Il-marda ta 'Alzheimer (AD) m'għandhiex bijomarkaturi tal-proteini li jirriflettu l-patofiżjoloġija sottostanti multipla tagħha, u jfixklu l-progress tad-dijanjosi u t-trattament. Hawnhekk, nużaw proteomika komprensiva biex nidentifikaw bijomarkaturi tal-fluwidu ċerebrospinali (CSF) li jirrappreżentaw firxa wiesgħa ta 'patofiżjoloġija AD. L-ispettrometrija tal-massa multiplex identifikat madwar 3,500 u madwar 12,000 proteina f'AD CSF u fil-moħħ, rispettivament. L-analiżi tan-netwerk tal-proteome tal-moħħ solviet 44 modulu tal-bijodiversità, li 15 minnhom kienu jikkoinċidu mal-proteome tal-fluwidu ċerebrospinali. Il-markaturi CSF AD f'dawn il-moduli li jikkoinċidu huma mitwija f'ħames gruppi ta 'proteini, li jirrappreżentaw proċessi patofiżjoloġiċi differenti. Is-sinapsi u l-metaboliti fil-moħħ AD jonqsu, iżda s-CSF jiżdied, filwaqt li l-mjelinazzjoni b'ħafna glial u l-gruppi immuni fil-moħħ u fis-CSF jiżdiedu. Il-konsistenza u l-ispeċifiċità tal-mard tal-bidliet tal-panel ġew ikkonfermati f'aktar minn 500 kampjun addizzjonali ta' CSF. Dawn il-gruppi identifikaw ukoll sottogruppi bijoloġiċi f'AD bla sintomi. B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati huma pass promettenti lejn għodod tal-bijomarkaturi bbażati fuq il-web għal applikazzjonijiet kliniċi fl-AD.
Il-marda ta 'Alzheimer (AD) hija l-aktar kawża komuni ta' dimenzja newrodeġenerattiva mad-dinja kollha u hija kkaratterizzata minn firxa wiesgħa ta 'disfunzjonijiet tas-sistema bijoloġika, inkluża t-trasmissjoni sinaptika, immunità medjata mill-glial, u metaboliżmu mitokondrijali (1-3). Madankollu, il-bijomarkaturi tal-proteini stabbiliti tagħha għadhom jiffokaw fuq l-iskoperta tal-proteini amilojde u tau, u għalhekk ma jistgħux jirriflettu din il-patofiżjoloġija diversa. Dawn il-bijomarkaturi tal-proteini "qalba" li huma mkejla b'mod l-aktar affidabbli fil-fluwidu ċerebrospinali (CSF) jinkludu (i) beta peptide amyloid 1-42 (Aβ1-42), li jirrifletti l-formazzjoni ta 'plakki amilojdi kortikali; (ii) tau totali, sinjal ta' deġenerazzjoni axon; (iii) phospho-tau (p-tau), rappreżentant ta 'iperfosforilazzjoni tau patoloġika (4-7). Għalkemm dawn il-bijomarkaturi tal-fluwidu ċerebrospinali ffaċilitaw ħafna l-iskoperta tagħna ta 'mard tal-proteini AD "immarkat" (4-7), huma jirrappreżentaw biss parti żgħira mill-bijoloġija kumplessa wara l-marda.
In-nuqqas ta 'diversità patofiżjoloġika ta' bijomarkaturi AD wassal għal ħafna sfidi, inkluż (i) in-nuqqas ta 'kapaċità li tiġi identifikata u kwantifikata l-eteroġeneità bijoloġika ta' pazjenti AD, (ii) kejl insuffiċjenti tas-severità u l-progressjoni tal-marda, speċjalment fl-istadju prekliniku, U ( iii) l-iżvilupp ta 'mediċini terapewtiċi li naqsu milli jsolvu kompletament l-aspetti kollha ta' deterjorament newroloġiku. Id-dipendenza tagħna fuq patoloġija importanti biex niddeskrivu l-AD minn mard relatat biss taggrava dawn il-problemi. Aktar u aktar evidenza juru li ħafna nies anzjani bid-dimenzja għandhom aktar minn karatteristika patoloġika waħda ta 'tnaqqis konjittiv (8). Sa 90% jew aktar ta 'individwi b'patoloġija AD għandhom ukoll mard vaskulari, inklużjonijiet TDP-43, jew mard deġenerattiv ieħor (9). Dawn il-proporzjonijiet għoljin ta 'koinċidenza patoloġika ħarbtu l-qafas dijanjostiku attwali tagħna għad-dimenzja, u hija meħtieġa definizzjoni patofiżjoloġika aktar komprensiva tal-marda.
Fid-dawl tal-ħtieġa urġenti għal varjetà ta 'bijomarkaturi AD, il-qasam qed jadotta dejjem aktar il-metodu "omics" ibbażat fuq is-sistema ġenerali biex jiskopru bijomarkaturi. Is-Sħubija Farmaċewtika Aċċellerata (AMP)-AD Alliance tnediet fl-2014 u tinsab fuq quddiem nett tal-programm. Dan l-isforz multidixxiplinarju mill-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, l-akkademja u l-industrija għandu l-għan li juża strateġiji bbażati fuq is-sistema biex tiddefinixxi aħjar il-patofiżjoloġija tal-AD u tiżviluppa analiżi dijanjostika tal-bijodiversità u strateġiji ta 'trattament (10). Bħala parti minn dan il-proġett, il-proteomika tan-netwerk saret għodda promettenti għall-avvanz ta 'bijomarkaturi bbażati fuq is-sistema fl-AD. Dan l-approċċ imparzjali mmexxi mid-dejta jorganizza settijiet ta 'dejta tal-proteomika kumplessi fi gruppi jew "moduli" ta' proteini ko-espressi li huma assoċjati ma 'tipi speċifiċi ta' ċelluli, organelli u funzjonijiet bijoloġiċi (11-13). Kważi 12-il studju tal-proteomika tan-netwerk b'ħafna informazzjoni saru fuq il-moħħ AD (13-23). B'mod ġenerali, dawn l-analiżi jindikaw li l-proteoma tan-netwerk tal-moħħ AD iżomm organizzazzjoni modulari kkonservata ħafna f'koorti indipendenti u reġjuni kortikali multipli. Barra minn hekk, xi wħud minn dawn il-moduli juru bidliet riproduċibbli fl-abbundanza relatata mal-AD f'settijiet ta 'dejta, li jirriflettu l-patofiżjoloġija ta' mard multipli. B'mod kollettiv, dawn is-sejbiet juru punt ta 'ankra promettenti għall-iskoperta tal-proteoma tan-netwerk tal-moħħ bħala bijomarkatur ibbażat fuq is-sistema fl-AD.
Sabiex tittrasforma l-proteoma tan-netwerk tal-moħħ AD f'bijomarkaturi klinikament utli bbażati fuq is-sistema, għaqqadna n-netwerk derivat mill-moħħ mal-analiżi proteomika ta 'AD CSF. Dan l-approċċ integrat wassal għall-identifikazzjoni ta 'ħames settijiet promettenti ta' bijomarkaturi CSF li huma assoċjati ma 'firxa wiesgħa ta' patofiżjoloġija bbażata fuq il-moħħ, inklużi sinapsi, vini tad-demm, majelinazzjoni, infjammazzjoni u disfunzjoni ta 'mogħdijiet metaboliċi. Aħna vvalidajna b'suċċess dawn il-pannelli tal-bijomarkaturi permezz ta 'analiżi ta' replikazzjoni multipli, inklużi aktar minn 500 kampjun CSF minn diversi mard newrodeġenerattiv. Dawn l-analiżi ta’ validazzjoni jinkludu l-eżaminazzjoni ta’ miri tal-grupp fis-CSF ta’ pazjenti b’AD asintomatiku (AsymAD) jew li juru evidenza ta’ akkumulazzjoni anormali ta’ amilojde f’ambjent konjittiv normali. Dawn l-analiżi jenfasizzaw l-eteroġeneità bijoloġika sinifikanti fil-popolazzjoni AsymAD u jidentifikaw markaturi tal-pannelli li jistgħu jkunu kapaċi jissottotipjaw individwi fl-aktar stadji bikrija tal-marda. B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jirrappreżentaw pass ewlieni fl-iżvilupp ta 'għodod tal-bijomarkaturi tal-proteini bbażati fuq sistemi multipli li jistgħu jsolvu b'suċċess ħafna mill-isfidi kliniċi li jiffaċċja l-AD.
L-għan ewlieni ta 'dan l-istudju huwa li jiġu identifikati bijomarkaturi ġodda tal-fluwidu ċerebrospinali li jirriflettu diversi patofiżjoloġija bbażata fuq il-moħħ li jwasslu għal AD. Figura S1 tiddeskrivi l-metodoloġija tar-riċerka tagħna, li tinkludi (i) analiżi komprensiva mmexxija minn sejbiet preliminari ta 'AD CSF u l-proteome tal-moħħ tan-netwerk biex jiġu identifikati bijomarkaturi multipli tal-mard tas-CSF relatati mal-moħħ, u (ii) replikazzjoni sussegwenti Dawn il-bijomarkaturi huma f'diversi ċerebrospinali indipendenti. koorti fluwidi. Ir-riċerka orjentata lejn l-iskoperta bdiet bl-analiżi tal-espressjoni differenzjali tas-CSF f'20 individwu konjittivament normali u 20 pazjent AD fiċ-Ċentru ta 'Riċerka tal-Mard ta' Emory Goizueta Alzheimer (ADRC). Id-dijanjosi ta 'AD hija definita bħala indeboliment konjittiv sinifikanti fil-preżenza ta' Aβ1-42 baxx u livelli elevati ta 'tau totali u p-tau fil-fluwidu ċerebrospinali [Valutazzjoni Konjittiva Medja ta' Montreal (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabella S1A). Il-kontroll (MoCA medju, 26.7 ± 2.2) kellu livelli normali ta 'bijomarkaturi CSF.
Is-CSF tal-bniedem huwa kkaratterizzat minn firxa dinamika ta 'abbundanza ta' proteini, li fiha albumina u proteini estremament abbundanti oħra jistgħu jipprevjenu l-iskoperta ta 'proteini ta' interess (24). Biex inżidu l-fond tal-iskoperta tal-proteini, neħħejna l-ewwel 14-il proteina abbundanti ħafna minn kull kampjun CSF qabel l-analiżi tal-ispettrometrija tal-massa (MS) (24). Total ta '39,805 peptide ġew identifikati mill-MS, li ġew immappjati għal 3691 proteome f'40 kampjun. Il-kwantifikazzjoni tal-proteini titwettaq permezz ta 'tikkettjar multipli tandem massa (TMT) (18, 25). Sabiex insolvu d-dejta nieqsa, inkludejna biss dawk il-proteini li kienu kkwantifikati f'mill-inqas 50% tal-kampjuni fl-analiżi sussegwenti, u b'hekk fl-aħħar ikkwantifikajna 2875 proteomi. Minħabba d-differenza sinifikanti fil-livelli ta’ abbundanza totali ta’ proteini, kampjun ta’ kontroll kien statistikament ikkunsidrat bħala barra (13) u ma kienx inkluż fl-analiżi sussegwenti. Il-valuri tal-abbundanza tad-39 kampjun li jifdal ġew aġġustati skont l-età, is-sess u l-kovarjanza tal-lott (13-15, 17, 18, 20, 26).
Bl-użu ta 'analiżi statistika tat-test t biex tevalwa l-espressjoni differenzjali fuq is-sett tad-dejta tar-rigressjoni, din l-analiżi identifikat proteini li l-livelli ta' abbundanza tagħhom inbidlu b'mod sinifikanti (P <0.05) bejn il-każijiet ta 'kontroll u AD (Tabella S2A). Kif muri fil-Figura 1A, l-abbundanza ta 'total ta' 225 proteina fl-AD tnaqqset b'mod sinifikanti, u l-abbundanza ta '303 proteini żdiedet b'mod sinifikanti. Dawn il-proteini espressi b'mod differenzjat jinkludu diversi markaturi AD tal-fluwidu ċerebrospinali identifikati qabel, bħal proteina assoċjata mal-mikrotubuli tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), newrofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Proteina 43 relatata mat-tkabbir. (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 bħal 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Newral Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10-4) u fattur tat-tkabbir tan-nervituri VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Madankollu, identifikajna wkoll miri oħra importanti ħafna, bħall-inibitur tad-dissoċjazzjoni tal-PGD 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) u l-irbit tal-kalċju modulari relatat ma 'SPARC 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). L-analiżi tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) ta '225 proteini mnaqqsa b'mod sinifikanti żvelat konnessjonijiet mill-qrib ma' proċessi ta 'fluwidu tal-ġisem bħal metaboliżmu ta' sterojdi, koagulazzjoni tad-demm u attività tal-ormoni (Figura 1B u Tabella S2B). B'kuntrast, il-proteina miżjuda b'mod sinifikanti ta '303 hija relatata mill-qrib mal-istruttura taċ-ċelluli u l-metaboliżmu tal-enerġija.
(A) Il-plott tal-vulkan juri l-bidla log2 darbiet (assi x) relattiva għall-valur P statistiku -log10 (assi y) miksub mit-test t, li jintuża biex jikxef espressjoni differenzjali bejn il-kontroll (CT) u Każijiet AD tal-proteome CSF Tal-proteini kollha. Proteini b'livelli mnaqqsa b'mod sinifikanti (P <0.05) f'AD huma murija bil-blu, filwaqt li proteini b'livelli miżjuda b'mod sinifikanti fil-mard huma murija bl-aħmar. Il-proteina magħżula hija ttikkettjata. (B) L-ogħla termini GO relatati mal-proteina huma mnaqqsa b'mod sinifikanti (blu) u miżjuda (aħmar) f'AD. Juri t-tliet termini GO bl-ogħla z-scores fl-oqsma tal-proċessi bijoloġiċi, il-funzjonijiet molekulari, u l-komponenti ċellulari. (C) MS imkejjel il-livell MAPT fil-kampjun CSF (xellug) u l-korrelazzjoni tiegħu mal-livell ELISA tau tal-kampjun (lemin). Il-koeffiċjent ta' korrelazzjoni Pearson mal-valur P rilevanti huwa muri. Minħabba n-nuqqas ta' dejta ELISA għal każ wieħed ta' AD, dawn iċ-ċifri jinkludu valuri għal 38 mid-39 każ analizzat. (D) Analiżi ta 'cluster sorveljata (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) aġġustat P <0.01) fuq il-kontroll u AD CSF sabet kampjuni bl-użu ta' 65 proteina l-aktar mibdula b'mod sinifikanti fis-sett tad-dejta. Istandardizza, innormalizza.
Il-livell proteomiku ta 'MAPT huwa relatat mill-qrib mal-livell tau ELISA mkejjel b'mod indipendenti (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figura 1C), li jappoġġja l-validità tal-kejl MS tagħna. Wara d-diġestjoni tat-tripsin fil-livell tal-proteina prekursur tal-amilojde (APP), il-peptidi speċifiċi għall-isoforma mappjati fis-C-terminal ta 'Aβ1-40 u Aβ1-42 ma jistgħux jiġu jonizzati b'mod effiċjenti (27, 28). Għalhekk, il-peptidi APP li identifikajna m'għandhom x'jaqsmu xejn mal-livelli ta 'ELISA Aβ1-42. Sabiex nevalwaw l-espressjoni differenzjali ta 'kull każ, użajna proteini espressi b'mod differenzjali b'P <0.0001 [rata ta' skoperta falza (FDR) korretta P <0.01] biex twettaq analiżi ta 'cluster sorveljata tal-kampjuni (Tabella S2A). Kif muri fil-Figura 1D, dawn il-65 proteina sinifikanti ħafna jistgħu jiġbru kampjuni b'mod korrett skont l-istat tal-marda, ħlief għal każ wieħed ta 'AD b'karatteristiċi ta' kontroll. Minn dawn il-65 proteina, 63 żdiedu fl-AD, filwaqt li tnejn biss (CD74 u ISLR) naqsu. B'kollox, dawn l-analiżi tal-fluwidu ċerebrospinali identifikaw mijiet ta 'proteini fl-AD li jistgħu jservu bħala bijomarkaturi tal-mard.
Imbagħad wettaqna analiżi tan-netwerk indipendenti tal-proteoma tal-moħħ AD. Il-koorti tal-moħħ ta 'din l-iskoperta inkludiet kortiċi prefrontali dorsolaterali (DLPFC) minn każijiet ta' kontroll (n = 10), marda ta 'Parkinson (PD; n = 10), AD/PD imħallat (n = 10) u AD (n = 10). ) Kampjun. Emery Goizueta ADRC. Id-demografija ta' dawn l-40 każ ġiet deskritta qabel (25) u hija miġbura fil-qosor fit-Tabella S1B. Aħna użajna TMT-MS biex nanalizzaw dawn l-40 tessut tal-moħħ u l-koorti ta 'replikazzjoni ta' 27 każ. B'kollox, dawn iż-żewġ settijiet ta 'dejta tal-moħħ ipproduċew 227,121 peptide uniku, li ġew immappjati għal 12,943 proteoma (25). Dawk il-proteini biss li ġew ikkwantifikati f'mill-inqas 50% tal-każijiet ġew inklużi f'investigazzjonijiet sussegwenti. Is-sett finali tad-dejta tal-iskoperta fih 8817 proteina kwantifikata. Aġġusta l-livelli tal-abbundanza tal-proteini bbażati fuq l-età, is-sess, u l-intervall post-mortem (PMI). L-analiżi tal-espressjoni differenzjali tas-sett tad-dejta wara rigressjoni wriet li > 2000 livelli ta 'proteina nbidlu b'mod sinifikanti [P <0.05, analiżi tal-varjanza (ANOVA)] f'żewġ koorti ta' mard jew aktar. Imbagħad, għamilna analiżi ta 'cluster sorveljata bbażata fuq il-proteini espressi b'mod differenzjali, u P <0.0001 f'paraguni AD / kontroll u / jew AD / PD (Figura S2, A u B, Tabella S2C). Dawn il-165 proteina mibdula ħafna juru b'mod ċar każijiet b'patoloġija AD mill-kampjuni ta 'kontroll u PD, li jikkonfermaw il-bidliet qawwija speċifiċi għall-AD fil-proteome kollu.
Imbagħad użajna algoritmu msejjaħ Analiżi tan-Netwerk tal-Ko-espressjoni tal-Ġene Weighted (WGCNA) biex twettaq analiżi tan-netwerk fuq il-proteome tal-moħħ skopert, li jorganizza s-sett tad-dejta f'moduli ta 'proteini b'xejriet ta' espressjoni simili (11-13). L-analiżi identifikat 44 modulu (M) proteini ko-espressi, magħżula u nnumerati mill-akbar (M1, n = 1821 proteini) għall-iżgħar (M44, n = 34 proteini) (Figura 2A u Tabella S2D) ). Kif imsemmi hawn fuq (13) Ikkalkula l-profil ta 'espressjoni rappreżentattiva jew proteina karatteristika ta' kull modulu, u jikkorrelataw ma 'l-istat tal-marda u l-patoloġija AD, jiġifieri, tistabbilixxi l-alleanza tar-Reġistru tal-Mard ta' Alzheimer (CERAD) u Score Braak (Figura 2B). B'mod ġenerali, 17-il modulu kienu relatati b'mod sinifikanti man-newropatoloġija tal-AD (P <0.05). Ħafna minn dawn il-moduli relatati mal-mard huma wkoll sinjuri f'markaturi speċifiċi għat-tip taċ-ċelluli (Figura 2B). Kif imsemmi hawn fuq (13), l-arrikkiment tat-tip taċ-ċellula huwa ddeterminat billi tiġi analizzata l-koinċidenza tal-moduli u l-lista ta 'referenza ta' ġeni speċifiċi għat-tip taċ-ċellula. Dawn il-ġeni huma derivati minn dejta ppubblikata f'newroni tal-ġrieden iżolati, ċelluli endoteljali u gliali. Esperiment tas-sekwenzjar tal-RNA (RNA-seq) (29).
(A) Skopri l-WGCNA tal-proteome tal-moħħ. (B) Analiżi biweight midkorrelation (BiCor) tal-proteina tal-firma modulari (l-ewwel komponent ewlieni ta 'espressjoni ta' proteina modulari) b'karatteristiċi newropatoloġiċi AD (fuq), inklużi punteġġi CERAD (plakka Aβ) u Braak (tau tangles). L-intensitajiet ta 'korrelazzjonijiet pożittivi (aħmar) u negattivi (blu) huma murija minn mappa tas-sħana b'żewġ kuluri, u l-asterisks jindikaw sinifikat statistiku (P <0.05). Uża Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (qiegħ) biex tevalwa l-assoċjazzjoni tat-tip taċ-ċellula ta 'kull modulu tal-proteina. L-intensità tad-dell aħmar tindika l-grad ta 'arrikkiment tat-tip taċ-ċellula, u l-asterisk jindika sinifikat statistiku (P <0.05). Uża l-metodu BH biex tikkoreġi l-valur P derivat mill-FET. (C) Analiżi GO ta 'proteini modulari. L-aktar proċessi bijoloġiċi relatati mill-qrib jintwerew għal kull modulu jew grupp ta 'moduli relatati. oligo, oligodendrocyte.
Sett ta 'ħames moduli b'ħafna astroċiti u mikroglia relatati mill-qrib (M30, M29, M18, M24, u M5) wera korrelazzjoni pożittiva qawwija man-newropatoloġija AD (Figura 2B). L-analiżi tal-ontoloġija torbot dawn il-moduli gliali mat-tkabbir taċ-ċelluli, il-proliferazzjoni u l-immunità (Figura 2C u Tabella S2E). Żewġ moduli glial addizzjonali, M8 u M22, huma wkoll regolati b'mod qawwi fil-mard. M8 huwa relatat ħafna mal-mogħdija tar-riċettur li jixbhu Toll, kaskata ta 'sinjalazzjoni li għandha rwol ewlieni fir-rispons immuni intrinsiku (30). Fl-istess ħin, M22 huwa relatat mill-qrib mal-modifika ta 'wara t-traduzzjoni. M2, li huwa għani fl-oligodendrocytes, juri korrelazzjoni pożittiva qawwija mal-patoloġija AD u konnessjoni ontoloġika mas-sinteżi tan-nukleosidi u r-replikazzjoni tad-DNA, li tindika proliferazzjoni msaħħa taċ-ċelluli fil-mard. B'mod ġenerali, dawn is-sejbiet jappoġġjaw l-elevazzjoni ta 'moduli glial li qabel osservajna fil-proteome tan-netwerk AD (13, 17). Bħalissa jinstab li ħafna moduli glial relatati mal-AD fin-netwerk juru livelli ta 'espressjoni aktar baxxi f'każijiet ta' kontroll u PD, li jenfasizzaw l-ispeċifiċità tal-marda tagħhom li hija elevata f'AD (Figura S2C).
Erba 'moduli biss fil-proteome tan-netwerk tagħna (M1, M3, M10, u M32) huma korrelatati b'mod negattiv qawwi mal-patoloġija AD (P <0.05) (Figura 2, B u C). Kemm M1 kif ukoll M3 huma sinjuri f'markaturi newronali. M1 huwa relatat ħafna mas-sinjali sinaptiċi, filwaqt li M3 huwa relatat mill-qrib mal-funzjoni mitokondrijali. M'hemm l-ebda evidenza ta' arrikkiment tat-tip taċ-ċellula għal M10 u M32. M32 jirrifletti l-konnessjoni bejn M3 u l-metaboliżmu taċ-ċelluli, filwaqt li M10 huwa relatat ħafna mat-tkabbir taċ-ċelluli u l-funzjoni tal-mikrotubuli. Meta mqabbel ma 'AD, l-erba' moduli kollha huma miżjuda fil-kontroll u l-PD, u jagħtuhom bidliet AD speċifiċi għall-mard (Figura S2C). B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jappoġġjaw l-abbundanza mnaqqsa ta 'moduli b'ħafna newroni li qabel osservajna f'AD (13, 17). Fil-qosor, l-analiżi tan-netwerk tal-proteome tal-moħħ li skoprejna pproduċiet moduli mibdula speċifikament għall-AD konsistenti mas-sejbiet preċedenti tagħna.
AD huwa kkaratterizzat minn stadju asintomatiku bikri (AsymAD), li fih l-individwi juru akkumulazzjoni ta 'amilojde mingħajr tnaqqis konjittiv kliniku (5, 31). Dan l-istadju asintomatiku jirrappreżenta tieqa kritika għal skoperta u intervent bikri. Preċedentement urejna preservazzjoni modulari qawwija ta 'proteome tan-netwerk tal-moħħ AsymAD u AD f'settijiet ta' dejta indipendenti (13, 17). Sabiex niżguraw li n-netwerk tal-moħħ li skoprejna bħalissa huwa konsistenti ma 'dawn is-sejbiet preċedenti, analizzajna l-preservazzjoni ta' 44 modulu fis-sett ta 'dejta replikat minn 27 organizzazzjoni DLPFC. Dawn l-organizzazzjonijiet jinkludu każijiet ta 'kontroll (n = 10), AsymAD (n = 8) U AD (n = 9). Kampjuni ta 'kontroll u AD ġew inklużi fl-analiżi tal-koorti tal-moħħ tal-iskoperta tagħna (Tabella S1B), filwaqt li l-każijiet AsymAD kienu uniċi biss fil-koorti ta' replikazzjoni. Dawn il-każijiet AsymAD ġew ukoll mill-bank tal-moħħ Emory Goizueta ADRC. Għalkemm il-konjizzjoni kienet normali fil-ħin tal-mewt, il-livelli tal-amilojde kienu għoljin b'mod anormali (medja CERAD, 2.8 ± 0.5) (Tabella S1B).
L-analiżi TMT-MS ta 'dawn is-27 tessut tal-moħħ irriżulta fil-kwantifikazzjoni ta' 11,244 proteoma. Dan l-għadd finali jinkludi biss dawk il-proteini kwantifikati f'mill-inqas 50% tal-kampjuni. Dan is-sett tad-dejta replikat fih 8638 (98.0%) mill-8817-il proteina misjuba fl-analiżi tal-moħħ tal-iskoperta tagħna, u għandha kważi 3000 proteina mibdula b'mod sinifikanti bejn il-koorti tal-kontroll u l-AD (P <0.05, wara t-test paired t ta' Tukey għall-analiżi tal-varjanza) ( Tabella S2F). Fost dawn il-proteini espressi b'mod differenzjat, 910 wera wkoll bidliet sinifikanti fil-livell bejn każijiet ta 'kontroll tal-AD u tal-proteome tal-moħħ (P <0.05, wara t-test paired ANOVA Tukey). Ta 'min jinnota li dawn il-markaturi 910 huma konsistenti ħafna fid-direzzjoni tal-bidla bejn il-proteomes (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figura S3A). Fost il-proteini miżjuda, il-proteini bl-aktar bidliet konsistenti bejn settijiet ta 'dejta huma prinċipalment membri tal-moduli M5 u M18 b'ħafna glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, u GFAP). Fost il-proteini mnaqqsa, dawk bl-aktar bidliet konsistenti kienu kważi esklussivament membri tal-modulu M1 (NPTX2, VGF, u RPH3A) assoċjati mas-sinapsi. Aħna vverifikajna aktar il-bidliet relatati mal-AD ta 'midkine (MDK), CD44, proteina 1 relatata mal-frizzled imnixxija (SFRP1) u VGF permezz ta' western blotting (Figura S3B). L-analiżi tal-preservazzjoni tal-modulu wriet li madwar 80% tal-moduli tal-proteini (34/44) fil-proteome tal-moħħ kienu kkonservati b'mod sinifikanti fis-sett tad-dejta ta 'replikazzjoni (z-score> 1.96, FDR korretta P <0.05) (Figura S3C). Erbatax minn dawn il-moduli kienu riżervati apposta bejn iż-żewġ proteomi (z-score> 10, P ikkoreġut FDR <1.0 × 10-23). B'mod ġenerali, l-iskoperta u r-replikazzjoni tal-grad għoli ta 'konsistenza fl-espressjoni differenzjali u l-kompożizzjoni modulari bejn il-proteome tal-moħħ tenfasizza r-riproduċibbiltà tal-bidliet fil-proteini tal-kortiċi frontali AD. Barra minn hekk, ikkonferma wkoll li AsymAD u mard aktar avvanzat għandhom struttura ta 'netwerk tal-moħħ simili ħafna.
Analiżi aktar dettaljata tal-espressjoni differenzjali fis-sett tad-dejta tar-replikazzjoni tal-moħħ tenfasizza l-grad sinifikanti ta 'bidliet fil-proteini AsymAD, inkluż total ta' 151 proteina mibdula b'mod sinifikanti bejn AsymAD u l-kontroll (P <0.05) (Figura S3D). B'mod konsistenti mat-tagħbija tal-amilojde, APP fil-moħħ ta 'AsymAD u AD żdied b'mod sinifikanti. MAPT jinbidel biss b'mod sinifikanti fl-AD, li huwa konsistenti ma 'livelli miżjuda ta' tħabbil u l-korrelazzjoni magħrufa tiegħu ma 'tnaqqis konjittiv (5, 7). Il-moduli b'ħafna glial (M5 u M18) huma riflessi ħafna fil-proteini miżjuda f'AsymAD, filwaqt li l-modulu M1 relatat man-newroni huwa l-aktar rappreżentattiv tal-proteini mnaqqsa f'AsymAD. Ħafna minn dawn il-markaturi AsymAD juru bidliet akbar fil-mard sintomatiku. Fost dawn il-markaturi hemm SMOC1, proteina glial li tappartjeni għal M18, li hija assoċjata ma 'tumuri tal-moħħ u l-iżvilupp ta' għajnejn u riġlejn (32). MDK huwa fattur tat-tkabbir li jorbot lill-eparina relatat mat-tkabbir taċ-ċelluli u l-anġjoġenesi (33), membru ieħor ta 'M18. Meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, AsymAD żdied b'mod sinifikanti, segwit minn żieda akbar fl-AD. B'kuntrast, il-proteina sinaptika neuropentraxin 2 (NPTX2) tnaqqset b'mod sinifikanti fil-moħħ AsymAD. NPTX2 qabel kien assoċjat man-newrodeġenerazzjoni u għandu rwol rikonoxxut fil-medjazzjoni tas-sinapsi eċċitatorji (34). B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jiżvelaw varjetà ta 'bidliet differenti ta' proteini prekliniċi fl-AD li jidhru li qed jipprogressaw mas-severità tal-marda.
Minħabba li ksibna fond sinifikanti ta 'kopertura ta' proteini fl-iskoperta tal-proteome tal-moħħ, qed nippruvaw nifhmu aktar bis-sħiħ ir-rikinċidenza tagħha mat-traskriptoma AD fil-livell tan-netwerk. Għalhekk, qabbilna l-proteome tal-moħħ li skoprejna mal-modulu li ġġenerajna qabel mill-kejl tal-mikroarray ta '18,204 ġeni f'AD (n = 308) u kontroll (n = 157) tessuti DLPFC (13). jikkoinċidu. B'kollox, identifikajna 20 modulu RNA differenti, li ħafna minnhom wrew l-arrikkiment ta 'tipi speċifiċi ta' ċelluli, inklużi newroni, oligodendroċiti, astroċiti u mikroglia (Figura 3A). Il-bidliet multipli ta 'dawn il-moduli f'AD huma murija fil-Figura 3B. B'mod konsistenti mal-analiżi preċedenti tagħna ta' koinċidenza proteina-RNA bl-użu tal-proteome MS mhux tikkettat aktar fil-fond (madwar 3000 proteina) (13), il-biċċa l-kbira tal-44 modulu fin-netwerk tal-proteome tal-moħħ li sibna huma fin-netwerk tat-traskriptome M'hemm l-ebda sovrappożizzjoni sinifikanti. l-iskoperta u r-replikazzjoni tagħna tal-34 modulu tal-proteina li huma miżmuma ħafna fil-proteome tal-moħħ, 14 biss (~ 40%) għaddew mit-test eżatt ta 'Fisher (FET) urew li għandhom koinċidenza statistikament sinifikanti mat-traskriptome (Figura 3A). Kompatibbli mat-tiswija tal-ħsara fid-DNA (P-M25 u P-M19), it-traduzzjoni tal-proteini (P-M7 u P-M20), it-twaħħil/l-isplicing tal-RNA (P-M16 u P-M21) u l-immirar tal-proteini (P-M13 u P- M23) ma jikkoinċidux ma 'moduli fit-traskriptome. Għalhekk, għalkemm sett ta 'dejta tal-proteome aktar fil-fond jintuża fl-analiżi ta' sovrapożizzjoni attwali (13), il-biċċa l-kbira tal-proteoma tan-netwerk AD mhix immappjata man-netwerk tat-traskriptoma.
(A) FET iperġeometriku juri l-arrikkiment ta 'markaturi speċifiċi għat-tip taċ-ċelluli fil-modulu RNA tat-traskriptome AD (fuq) u l-grad ta' koinċidenza bejn il-moduli RNA (assi x) u proteini (assi y) tal-moħħ AD (qiegħ). L-intensità tad-dell aħmar tindika l-grad ta 'arrikkiment tat-tipi ta' ċelluli fil-pannell ta 'fuq u l-intensità tal-koinċidenza tal-moduli fil-pannell ta' isfel. L-asterisks jindikaw sinifikat statistiku (P <0.05). (B) Il-grad ta 'korrelazzjoni bejn il-ġeni karatteristiċi ta' kull modulu tat-traskriptome u l-istatus ta 'AD. Il-moduli fuq ix-xellug huma l-aktar korrelatati negattivament ma 'AD (blu), u dawk fuq il-lemin huma l-aktar korrelatati b'mod pożittiv ma' AD (aħmar). Il-valur P ikkoreġut bil-log trasformat BH jindika l-grad ta 'sinifikat statistiku ta' kull korrelazzjoni. (C) Moduli sinifikattivi li jikkoinċidu b'arrikkiment tat-tip taċ-ċelluli kondiviżi. (D) Analiżi ta 'korrelazzjoni tal-bidla log2 darbiet tal-proteina ttikkettjata (assi x) u RNA (assi y) fil-modulu li jikkoinċidi. Il-koeffiċjent ta' korrelazzjoni Pearson mal-valur P rilevanti huwa muri. Mikro, mikroglia; korpi ċelesti, astroċiti. CT, kontroll.
Il-biċċa l-kbira tal-moduli ta 'proteina u RNA li jikkoinċidu jaqsmu profili simili ta' arrikkiment tat-tip ta 'ċelluli u AD konsistenti jibdlu direzzjonijiet (Figura 3, B u C). Fi kliem ieħor, il-modulu M1 relatat mas-sinapsi tal-proteoma tal-moħħ (PM1) huwa mmappjat għal tliet moduli RNA omologu b'ħafna newronali (R-M1, R-M9 u R-M16), li huma f'AD It-tnejn urew livell imnaqqas. Bl-istess mod, il-moduli tal-proteina M5 u M18 b'ħafna glial jikkoinċidu ma 'moduli RNA sinjuri f'astroċiti u markaturi mikrogliali (R-M3, R-M7, u R-M10) u huma involuti ħafna f'mard Żieda. Dawn il-karatteristiċi modulari kondiviżi bejn iż-żewġ settijiet ta 'dejta jappoġġjaw aktar l-arrikkiment tat-tip taċ-ċelluli u l-bidliet relatati mal-mard li osservajna fil-proteome tal-moħħ. Madankollu, osservajna ħafna differenzi sinifikanti bejn il-livelli ta 'RNA u proteini ta' markaturi individwali f'dawn il-moduli kondiviżi. L-analiżi tal-korrelazzjoni tal-espressjoni differenzjali tal-proteomika u t-traskriptomika tal-molekuli fi ħdan dawn il-moduli li jikkoinċidu (Figura 3D) tenfasizza din l-inkonsistenza. Pereżempju, APP u diversi proteini oħra tal-modulu glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, u SFRP1) wrew żieda sinifikanti fil-proteome AD, iżda ma kien hemm kważi l-ebda bidla fit-transcriptome AD. Dawn il-bidliet speċifiċi għall-proteini jistgħu jkunu relatati mill-qrib ma 'plakek amilojdi (23, 35), li jenfasizzaw il-proteome bħala s-sors ta' bidliet patoloġiċi, u dawn il-bidliet jistgħu ma jiġux riflessi fit-transcriptome.
Wara li analizzajna b'mod indipendenti l-proteomi tal-moħħ u tas-CSF li skoprejna, għamilna analiżi komprensiva taż-żewġ settijiet ta 'dejta biex nidentifikaw bijomarkaturi AD CSF relatati mal-patofiżjoloġija tan-netwerk tal-moħħ. L-ewwel irridu niddefinixxu l-koinċidenza taż-żewġ proteomi. Għalkemm huwa aċċettat b'mod wiesa 'li CSF jirrifletti bidliet newrokimiċi fil-moħħ AD (4), il-grad eżatt ta' koinċidenza bejn il-moħħ AD u l-proteome CSF mhuwiex ċar. Billi tqabbel in-numru ta 'prodotti tal-ġeni kondiviżi misjuba fiż-żewġ proteomi tagħna, sibna li kważi 70% (n = 1936) tal-proteini identifikati fil-fluwidu ċerebrospinali kienu wkoll kwantifikati fil-moħħ (Figura 4A). Ħafna minn dawn il-proteini li jikkoinċidu (n = 1721) huma mmappjati għal wieħed minn 44 modulu ta 'ko-espressjoni mis-sett tad-dejta tal-moħħ tal-iskoperta (Figura 4B). Kif mistenni, l-akbar sitt moduli tal-moħħ (M1 sa M6) urew l-akbar ammont ta 'koinċidenza CSF. Madankollu, hemm moduli tal-moħħ iżgħar (per eżempju, M15 u M29) li jiksbu grad għoli mhux mistenni ta 'koinċidenza, akbar minn modulu tal-moħħ id-doppju tad-daqs tiegħu. Dan jimmotivana biex nadottaw metodu aktar dettaljat u mmexxi statistikament biex nikkalkulaw il-koinċidenza bejn il-moħħ u l-fluwidu ċerebrospinali.
(A u B) Il-proteini misjuba fis-settijiet tad-dejta tal-moħħ tal-iskoperta u tas-CSF jikkoinċidu. Ħafna minn dawn il-proteini li jikkoinċidu huma assoċjati ma 'wieħed mill-44 modulu ta' ko-espressjoni tan-netwerk ta 'ko-espressjoni tal-moħħ. (C) Skopri l-koinċidenza bejn il-proteome tal-fluwidu ċerebrospinali u l-proteoma tan-netwerk tal-moħħ. Kull ringiela tal-mappa tas-sħana tirrappreżenta analiżi separata ta' sovrapożizzjoni tal-FET iperġeometriku. Ir-ringiela ta 'fuq turi l-koinċidenza (dell griż/iswed) bejn il-modulu tal-moħħ u l-proteome CSF kollu. It-tieni linja turi li l-koinċidenza bejn il-moduli tal-moħħ u l-proteina CSF (sfumata bl-aħmar) hija regolata b'mod sinifikanti 'l fuq f'AD (P <0.05). It-tielet ringiela turi li l-koinċidenza bejn il-moduli tal-moħħ u l-proteina CSF (dell blu) hija regolata b'mod sinifikanti 'l isfel f'AD (P <0.05). Uża l-metodu BH biex tikkoreġi l-valur P derivat mill-FET. (D) Panel tal-modulu li jintwew ibbażat fuq assoċjazzjoni tat-tip ta 'ċelluli u termini GO relatati. Dawn il-pannelli fihom total ta '271 proteina relatati mal-moħħ, li għandhom espressjoni differenzjali sinifikanti fil-proteome CSF.
Bl-użu ta 'FETs ta' denb wieħed, aħna vvalutajna l-importanza ta 'koinċidenza ta' proteini bejn il-proteome CSF u moduli tal-moħħ individwali. L-analiżi wriet li total ta '14-il modulu tal-moħħ fis-sett tad-dejta tas-CSF għandhom sovrapposizzjonijiet statistikament sinifikanti (FDR aġġustat P <0.05), u modulu addizzjonali (M18) li l-koinċidenza tiegħu hija qrib is-sinifikat (FDR aġġustat P = 0.06) (Figura 4C). , ringiela ta’ fuq). Aħna wkoll interessati f'moduli li jikkoinċidu b'mod qawwi ma 'proteini CSF espressi b'mod differenzjali. Għalhekk, applikajna żewġ analiżi FET addizzjonali biex niddeterminaw liema minn (i) proteina CSF żdiedet b'mod sinifikanti f'AD u (ii) proteina CSF naqset b'mod sinifikanti f'AD (P <0.05, paired t test AD / kontroll) Moduli tal-moħħ b'koinċidenza sinifikanti bejniethom. Kif muri fir-ringieli tan-nofs u tal-qiegħ tal-Figura 4C, dawn l-analiżi addizzjonali juru li 8 mill-44 modulu tal-moħħ jikkoinċidu b'mod sinifikanti mal-proteina miżjuda f'AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, u M38) . ), filwaqt li żewġ moduli biss (M6 u M15) wrew koinċidenza sinifikanti mal-proteina mnaqqsa f'AD CSF. Kif mistenni, l-10 moduli kollha huma fil-15-il modulu bl-ogħla koinċidenza mal-proteome CSF. Għalhekk, nassumu li dawn il-15-il modulu huma sorsi ta 'rendiment għoli ta' bijomarkaturi tas-CSF derivati mill-moħħ AD.
Aħna mitwija dawn il-15-il modulu li jikkoinċidu f'ħames pannelli kbar ta 'proteini bbażati fuq il-prossimità tagħhom fid-dijagramma tas-siġra WGCNA u l-assoċjazzjoni tagħhom ma' tipi ta 'ċelluli u ontoloġija tal-ġeni (Figura 4D). L-ewwel panel fih moduli sinjuri f'markaturi tan-newroni u proteini relatati mas-sinapsi (M1 u M12). Il-pannell sinaptiku fih total ta '94 proteina, u l-livelli fil-proteome CSF inbidlu b'mod sinifikanti, u jagħmilha l-akbar sors ta' markaturi CSF relatati mal-moħħ fost il-ħames pannelli. It-tieni grupp (M6 u M15) wera konnessjoni mill-qrib ma 'markaturi taċ-ċelluli endoteljali u korp vaskulari, bħal "fejqan tal-feriti" (M6) u "regolamentazzjoni ta' rispons immuni umorali" (M15). M15 huwa wkoll relatat ħafna mal-metaboliżmu tal-lipoproteini, li huwa relatat mill-qrib mal-endotelju (36). Il-pannell vaskulari fih 34 markatur CSF relatati mal-moħħ. It-tielet grupp jinkludi moduli (M2 u M4) li huma relatati b'mod sinifikanti mal-markaturi tal-oligodendrocyte u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli. Pereżempju, it-termini tal-ontoloġija tal-ogħla livell ta 'M2 jinkludu "regolamentazzjoni pożittiva tar-replikazzjoni tad-DNA" u "proċess ta' bijosintesi tal-purini". Sadanittant, dawk ta 'M4 jinkludu "differenzjazzjoni taċ-ċelluli gliali" u "segregazzjoni tal-kromożomi". Il-pannell tal-majelinazzjoni fih 49 markatur CSF relatati mal-moħħ.
Ir-raba 'grupp fih l-aktar moduli (M30, M29, M18, M24, u M5), u kważi l-moduli kollha huma sinifikament rikki f'markers mikroglia u astroċiti. Simili għall-pannell tal-majelinazzjoni, ir-raba 'pannell fih ukoll moduli (M30, M29, u M18) li huma relatati mill-qrib mal-proliferazzjoni taċ-ċelluli. Il-moduli l-oħra f'dan il-grupp huma relatati ħafna ma 'termini immunoloġiċi, bħal "proċess ta' effett immuni" (M5) u "regolazzjoni tar-rispons immuni" (M24). Il-grupp immuni glial fih 42 markatur CSF relatati mal-moħħ. Fl-aħħarnett, l-aħħar panel jinkludi 52 markatur relatati mal-moħħ fuq l-erba 'moduli (M44, M3, M33, u M38), li kollha huma fuq il-ġisem relatati mal-ħażna tal-enerġija u l-metaboliżmu. L-akbar minn dawn il-moduli (M3) huwa relatat mill-qrib mal-mitokondrija u huwa għani f'markaturi speċifiċi għan-newroni. M38 huwa wieħed mill-membri tal-modulu iżgħar f'dan il-metaboloma u juri wkoll speċifiċità moderata tan-newroni.
B'mod ġenerali, dawn il-ħames pannelli jirriflettu firxa wiesgħa ta 'tipi ta' ċelluli u funzjonijiet fil-kortiċi AD, u kollettivament fihom 271 markatur CSF relatati mal-moħħ (Tabella S2G). Sabiex nevalwaw il-validità ta’ dawn ir-riżultati tal-MS, użajna l-assaġġ tal-estensjoni tal-prossimità (PEA), teknoloġija ortogonali bbażata fuq antikorpi b’kapaċitajiet ta’ multiplexing, sensittività għolja u speċifiċità, u erġajna analizzajna l-kampjuni tal-fluwidu ċerebrospinali li sibna Subsett ta’ dawn il-271 bijomarkatur. (n = 36). Dawn il-miri 36 juru l-bidla fil-multiplu AD tal-PEA, li hija relatata mill-qrib mas-sejbiet tagħna bbażati fuq l-SM (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) , Li vverifikat bil-qawwa r-riżultati tal-analiżi komprensiva tagħna tal-MS (Figura S4). ).
It-temi bijoloġiċi enfasizzati mill-ħames gruppi tagħna, mis-sinjalar sinaptiku sal-metaboliżmu tal-enerġija, huma kollha relatati mal-patoġenesi tal-AD (1-3). Għalhekk, il-15-il modulu kollha li fihom dawn il-pannelli huma relatati mal-patoloġija AD fil-proteome tal-moħħ li skoprejna (Figura 2B). L-aktar notevoli hija l-korrelazzjoni patoloġika pożittiva għolja bejn il-moduli gliali tagħna u l-korrelazzjoni patoloġika negattiva qawwija bejn l-akbar moduli newronali tagħna (M1 u M3). L-analiżi tal-espressjoni differenzjali tal-proteoma tal-moħħ replikat tagħna (Figura S3D) tenfasizza wkoll proteini gliali derivati minn M5 u M18. F'AsymAD u AD sintomatiku, l-aktar proteini gliali miżjuda u sinapsi relatati ma 'M1 Il-proteina titnaqqas l-aktar. Dawn l-osservazzjonijiet jindikaw li l-markaturi tal-fluwidu ċerebrospinali 271 li identifikajna fil-ħames gruppi huma relatati ma 'proċessi ta' mard fil-kortiċi AD, inklużi dawk li jseħħu fl-istadji bikrija mingħajr sintomi.
Sabiex tanalizza aħjar id-direzzjoni tal-bidla tal-proteini tal-pannelli fil-moħħ u l-fluwidu tas-sinsla, ġibna dan li ġej għal kull wieħed mill-15-il modulu li jikkoinċidu: (i) sibna l-livell ta 'abbundanza tal-modulu fis-sett tad-dejta tal-moħħ u (ii) il-modulu proteina Id-differenza hija espressa fil-fluwidu ċerebrospinali (Figura S5). Kif issemma qabel, WGCNA jintuża biex jiddetermina l-abbundanza tal-modulu jew il-valur tal-proteina karatteristika fil-moħħ (13). Il-mappa tal-vulkan tintuża biex tiddeskrivi l-espressjoni differenzjali ta 'proteini modulari fil-fluwidu ċerebrospinali (AD/kontroll). Dawn iċ-ċifri juru li tlieta mill-ħames pannelli juru xejriet ta 'espressjoni differenti fil-moħħ u l-fluwidu tas-sinsla. Iż-żewġ moduli tal-pannell tas-sinapsi (M1 u M12) juru tnaqqis fil-livell ta 'abbundanza fil-moħħ AD, iżda jikkoinċidu b'mod sinifikanti mal-proteina miżjuda fl-AD CSF (Figura S5A). Il-moduli relatati man-newroni li fihom il-metaboloma (M3 u M38) urew mudelli simili ta 'espressjoni tal-moħħ u tal-fluwidu ċerebrospinali inkonsistenti (Figura S5E). Il-pannell vaskulari wera wkoll xejriet ta 'espressjoni differenti, għalkemm il-moduli tiegħu (M6 u M15) żdiedu b'mod moderat fil-moħħ AD u naqsu fis-CSF morda (Figura S5B). Iż-żewġ pannelli li fadal fihom netwerks gliali kbar li l-proteini tagħhom huma regolati b'mod konsistenti fiż-żewġ kompartimenti (Figura S5, C u D).
Jekk jogħġbok innota li dawn ix-xejriet mhumiex komuni għall-markaturi kollha f'dawn il-pannelli. Per eżempju, il-pannell sinaptiku jinkludi diversi proteini li huma mnaqqsa b'mod sinifikanti fil-moħħ AD u CSF (Figura S5A). Fost dawn il-markaturi tal-fluwidu ċerebrospinali regolati 'l isfel hemm NPTX2 u VGF ta' M1, u chromogranin B ta 'M12. Madankollu, minkejja dawn l-eċċezzjonijiet, ħafna mill-markaturi sinaptiċi tagħna huma elevati fil-fluwidu spinali AD. B'mod ġenerali, dawn l-analiżi kienu kapaċi jiddistingwu xejriet statistikament sinifikanti fil-livelli tal-moħħ u tal-fluwidu ċerebrospinali f'kull wieħed mill-ħames pannelli tagħna. Dawn ix-xejriet jenfasizzaw ir-relazzjoni kumplessa u spiss differenti bejn l-espressjoni tal-proteina tal-moħħ u tas-CSF fl-AD.
Imbagħad, użajna analiżi ta 'replikazzjoni MS high-throughput (replikazzjoni CSF 1) biex inaqqas is-sett 271 tagħna ta' bijomarkaturi għall-aktar miri promettenti u riproduċibbli (Figura 5A). Il-kopja CSF 1 fiha total ta' 96 kampjun minn Emory Goizueta ADRC, inkluż il-kontroll, AsymAD, u l-koorti AD (Tabella S1A). Dawn il-każijiet AD huma kkaratterizzati minn tnaqqis konjittiv ħafif (MoCA medju, 20.0 ± 3.8), u bidliet fil-bijomarkaturi AD ikkonfermati fil-fluwidu ċerebrospinali (Tabella S1A). Kuntrarjament għall-analiżi tas-CSF li sibna, din ir-replikazzjoni titwettaq bl-użu ta’ metodu MS “single-shot” aktar effiċjenti u b’rendiment għoli (mingħajr frazzjonament off-line), inkluż protokoll simplifikat ta’ preparazzjoni ta’ kampjuni li jelimina l-ħtieġa għal immunodepletion ta’ kampjuni individwali. . Minflok, jintuża "kanal ta' titjib" immuni wieħed imbattal biex jamplifika s-sinjal ta 'proteini inqas abbundanti (37). Għalkemm inaqqas il-kopertura totali tal-proteome, dan il-metodu ta 'shot wieħed inaqqas b'mod sinifikanti l-ħin tal-magna u jżid in-numru ta' kampjuni ttikkettjati bit-TMT li jistgħu jiġu analizzati vijabbli (17, 38). B'kollox, l-analiżi identifikat 6,487 peptide, li mmappjati għal 1,183 proteoma f'96 każ. Bħal fl-analiżi tas-CSF li sibna, dawk il-proteini kwantifikati biss f'mill-inqas 50% tal-kampjuni ġew inklużi fil-kalkoli sussegwenti, u d-dejta ġiet rigressjoni għall-effetti tal-età u s-sess. Dan wassal għall-kwantifikazzjoni finali ta' 792 proteoma, li 95% minnhom ġew identifikati wkoll fis-sett tad-dejta tas-CSF misjub.
(A) Miri tal-proteini CSF relatati mal-moħħ verifikati fl-ewwel koorti CSF replikat u inklużi fil-panel finali (n = 60). (B sa E) Livelli ta 'bijomarkaturi tal-pannelli (punteġġi z komposti) imkejla fl-erba' koorti ta 'replikazzjoni tas-CSF. Intużaw t-testijiet imqabbla jew ANOVA mal-korrezzjoni ta 'wara ta' Tukey biex jevalwaw is-sinifikat statistiku tal-bidliet fl-abbundanza f'kull analiżi replika. CT, kontroll.
Peress li aħna partikolarment interessati fil-verifika tal-271 mira tagħna tas-CSF relatati mal-moħħ permezz ta 'analiżi komprensiva, aħna se nillimitaw aktar eżami ta' dan il-proteome replikat għal dawn il-markaturi. Fost dawn il-271 proteina, 100 ġew skoperti fir-replikazzjoni tas-CSF 1. Il-Figura S6A turi l-espressjoni differenzjali ta 'dawn il-100 markatur li jikkoinċidu bejn il-kampjuni ta' replikazzjoni ta 'kontroll u AD. Istoni sinaptiċi u metaboliċi jiżdiedu l-aktar fl-AD, filwaqt li l-proteini vaskulari jonqsu l-aktar fil-mard. Ħafna mill-100 markatur li jikkoinċidu (n = 70) żammew l-istess direzzjoni tal-bidla fiż-żewġ settijiet ta 'dejta (Figura S6B). Dawn is-70 markatur CSF validati relatati mal-moħħ (Tabella S2H) jirriflettu fil-biċċa l-kbira t-tendenzi tal-espressjoni tal-pannelli osservati qabel, jiġifieri, ir-regolazzjoni 'l isfel tal-proteini vaskulari u r-regolazzjoni 'l fuq tal-pannelli l-oħra kollha. 10 biss minn dawn is-70 proteina validati wrew bidliet fl-abbundanza AD li kkontradixxu dawn ix-xejriet tal-panel. Sabiex niġġenera panel li jirrifletti l-aħjar ix-xejra ġenerali tal-moħħ u l-fluwidu ċerebrospinali, eskludejna dawn l-10 proteini mill-panel ta 'interess li finalment ivverifikajna (Figura 5A). Għalhekk, il-panel tagħna fl-aħħar mill-aħħar jinkludi total ta '60 proteina verifikata f'żewġ koorti CSF AD indipendenti li jużaw preparazzjoni ta' kampjuni differenti u analiżi tal-pjattaforma MS. Il-plots tal-espressjoni z-score ta 'dawn il-pannelli finali fil-kontroll tal-kopja CSF 1 u l-każijiet AD kkonfermaw it-tendenza tal-panel osservata fil-koorti CSF li sibna (Figura 5B).
Fost dawn is-60 proteina, hemm molekuli magħrufa li huma assoċjati ma 'AD, bħall-osteopontin (SPP1), li hija ċitokina pro-infjammatorja li ġiet assoċjata ma' AD f'ħafna studji (39-41), u GAP43, A proteina sinaptika li hija marbuta b'mod ċar man-newrodeġenerazzjoni (42). L-aktar proteini vverifikati bis-sħiħ huma markaturi relatati ma 'mard newrodeġenerattiv ieħor, bħal sklerożi laterali amjotrofika (ALS) relatata mas-superoxide dismutase 1 (SOD1) u desaccharase relatat mal-marda ta' Parkinson (PARK7). Aħna vverifikajna wkoll li ħafna markaturi oħra, bħal SMOC1 u proteina 1 ta 'sinjalazzjoni ta' sekwestru tal-membrana b'ħafna moħħ (BASP1), għandhom rabtiet preċedenti limitati man-newrodeġenerazzjoni. Ta 'min jinnota li minħabba l-abbundanza ġenerali baxxa tagħhom fil-proteome CSF, huwa diffiċli għalina li nużaw dan il-metodu ta' sejbien ta 'shot wieħed b'rendiment għoli biex niskopru b'mod affidabbli MAPT u ċerti proteini oħra relatati mal-AD (per eżempju, NEFL u NRGN ) ( 43, 44).
Imbagħad ivverifikajna dawn is-60 markatur tal-pannelli ta 'prijorità fi tliet analiżijiet replikati addizzjonali. F'CSF Kopja 2, użajna TMT-MS waħda biex tanalizza koorti indipendenti ta 'kampjuni ta' kontroll u AD 297 minn Emory Goizueta ADRC (17). Ir-replikazzjoni tas-CSF 3 inkludiet analiżi mill-ġdid tad-dejta TMT-MS disponibbli minn 120 pazjent ta 'kontroll u AD minn Lausanne, l-Isvizzera (45). Aħna skoprejna aktar minn żewġ terzi tas-60 markatur ta’ prijorità f’kull sett ta’ dejta. Għalkemm l-istudju Żvizzeru uża pjattaformi MS differenti u metodi ta 'kwantifikazzjoni TMT (45, 46), aħna rriproduċejna bil-qawwa t-tendenzi tal-pannelli tagħna f'żewġ analiżi ripetuti (Figura 5, C u D, u Tabelli S2, I, u J). Biex nevalwaw l-ispeċifiċità tal-marda tal-grupp tagħna, użajna TMT-MS biex tanalizza r-raba’ sett ta’ data ta’ replikazzjoni (replikazzjoni CSF 4), li kien jinkludi mhux biss każijiet ta’ kontroll (n = 18) u AD (n = 17), iżda wkoll PD ( n = 14)), ALS (n = 18) u kampjuni tad-dimenzja frontotemporal (FTD) (n = 11) (Tabella S1A). Aħna kkwantifikajna b'suċċess kważi żewġ terzi tal-proteini tal-pannelli f'din il-koorti (38 minn 60). Dawn ir-riżultati jenfasizzaw il-bidliet speċifiċi għall-AD fil-ħames pannelli tal-bijomarkaturi kollha (Figura 5E u Tabella S2K). Iż-żieda fil-grupp tal-metaboliti wriet l-aktar speċifiċità AD b'saħħitha, segwita mill-grupp ta 'mjelinazzjoni u glial. Sa ċertu punt, l-FTD juri wkoll żieda bejn dawn il-pannelli, li tista' tirrifletti bidliet potenzjali simili fin-netwerk (17). B'kuntrast, ALS u PD wrew kważi l-istess profili ta 'myelination, glial, u metabolome bħall-grupp ta' kontroll. B'mod ġenerali, minkejja d-differenzi fil-preparazzjoni tal-kampjun, il-pjattaforma MS, u l-metodi ta 'kwantifikazzjoni TMT, dawn l-analiżi ripetuti juru li l-markaturi tal-pannelli ta' prijorità tagħna għandhom bidliet speċifiċi għall-AD konsistenti ħafna f'aktar minn 500 kampjun uniku tas-CSF.
In-newrodeġenerazzjoni AD ġiet rikonoxxuta b'mod wiesa 'diversi snin qabel il-bidu tas-sintomi konjittivi, għalhekk hemm ħtieġa urġenti għal bijomarkaturi ta' AsymAD (5, 31). Madankollu, aktar u aktar evidenza juru li l-bijoloġija ta 'AsymAD hija 'l bogħod milli omoġenja, u l-interazzjoni kumplessa tar-riskju u r-reżiljenza twassal għal differenzi individwali kbar fil-progressjoni sussegwenti tal-marda (47). Għalkemm użati biex jidentifikaw każijiet AsymAD, il-livelli tal-bijomarkaturi ewlenin tas-CSF (Aβ1-42, tau totali u p-tau) ma wrewx li huma kapaċi jbassru b'mod affidabbli min se javvanza għad-dimenzja (4, 7), li jindika aktar Jista 'jkun meħtieġ li jiġu inklużi għodod tal-bijomarkaturi olistiċi bbażati fuq aspetti multipli tal-fiżjoloġija tal-moħħ biex jiġi stratifikat b'mod preċiż ir-riskju ta 'din il-popolazzjoni. Għalhekk, sussegwentement analizzajna l-panel tagħna tal-bijomarkaturi validati bl-AD fil-popolazzjoni AsymAD tal-kopja 1 tas-CSF. Dawn il-31 każ AsymAD wrew livelli anormali tal-bijomarkaturi tal-qalba (proporzjon Aβ1-42/total tau ELISA, <5.5) u konjizzjoni sħiħa (medja MoCA, 27.1). ± 2.2) (Tabella S1A). Barra minn hekk, l-individwi kollha b'AsymAD għandhom punteġġ ta 'dimenzja klinika ta' 0, li jindika li m'hemm l-ebda evidenza ta 'tnaqqis fil-prestazzjoni konjittiva jew funzjonali ta' kuljum.
L-ewwel analizzajna l-livelli tal-pannelli validati fis-96 replika CSF kollha 1, inkluża l-koorti AsymAD. Sibna li diversi pannelli fil-grupp AsymAD kellhom bidliet sinifikanti fl-abbundanza li jixbhu l-AD, il-pannell vaskulari wera xejra 'l isfel f'AsymAD, filwaqt li l-pannelli l-oħra kollha wrew xejra 'l fuq (Figura 6A). Għalhekk, il-pannelli kollha wrew korrelazzjoni sinifikanti ħafna ma 'ELISA Aβ1-42 u livelli totali tau (Figura 6B). B'kuntrast, il-korrelazzjoni bejn il-grupp u l-punteġġ MoCA hija relattivament fqira. Waħda mis-sejbiet l-aktar impressjonanti minn dawn l-analiżi hija l-firxa kbira ta 'abbundenzi tal-pannelli fil-koorti AsymAD. Kif muri fil-Figura 6A, il-livell tal-pannell tal-grupp AsymAD normalment jaqsam il-livell tal-pannell tal-grupp ta 'kontroll u l-grupp AD, li juri varjabbiltà relattivament għolja. Biex tesplora aktar din l-eteroġeneità ta 'AsymAD, applikajna analiżi ta' Scaling Multidimensjonali (MDS) għal 96 każ ta 'replikazzjoni CSF 1. L-analiżi tal-MDS tippermetti li wieħed iħares lejn ix-xebh bejn każijiet ibbażati fuq ċerti varjabbli fis-sett tad-dejta. Għal din l-analiżi tal-cluster, nużaw biss dawk il-markaturi tal-pannelli validati li għandhom bidla statistikament sinifikanti (P <0.05, AD/kontroll) fil-livell ta 'skoperta u replikazzjoni CSF 1 proteome (n = 29) (Tabella S2L). Din l-analiżi pproduċiet raggruppament spazjali ċar bejn il-każijiet ta 'kontroll u AD tagħna (Figura 6C). B'kuntrast, xi każijiet AsymAD huma raggruppati b'mod ċar fil-grupp ta 'kontroll, filwaqt li oħrajn jinsabu f'każijiet AD. Biex tesplora aktar din l-eteroġeneità AsymAD, użajna l-mappa MDS tagħna biex niddefinixxu żewġ gruppi ta 'dawn il-każijiet AsymAD. L-ewwel grupp inkluda każijiet AsymAD miġbura eqreb lejn il-kontroll (n = 19), filwaqt li t-tieni grupp kien ikkaratterizzat minn każijiet AsymAD bi profil markatur eqreb lejn AD (n = 12).
(A) Il-livell ta 'espressjoni (z-score) tal-grupp tal-bijomarkaturi tas-CSF fis-96 kampjun kollu fil-koorti 1 ta' replikazzjoni CSF, inkluż AsymAD. Analiżi tal-varjanza bil-korrezzjoni ta 'wara ta' Tukey intużat biex tevalwa s-sinifikat statistiku tal-bidliet fl-abbundanza tal-pannelli. (B) Analiżi ta 'korrelazzjoni tal-livell ta' abbundanza tal-proteini tal-pannelli (z-score) bil-punteġġ MoCA u l-livell tau totali f'kampjuni ELISA Aβ1-42 u CSF kopja 1. Il-koeffiċjent ta' korrelazzjoni Pearson mal-valur P rilevanti huwa muri. (C) L-MDS ta '96 każ CSF kopja 1 kienet ibbażata fuq il-livelli ta' abbundanza ta 'markaturi tal-pannelli validati 29, li nbidlu b'mod sinifikanti kemm fis-settijiet tad-dejta tal-iskoperta kif ukoll f'CSF kopja 1 [P <0.05 AD/kontroll (CT)]. Din l-analiżi ntużat biex jaqsam il-grupp AsymAD f'sottogruppi ta 'kontroll (n = 19) u AD (n = 12). (D) Il-plott tal-vulkan turi l-espressjoni differenzjali tal-proteini kollha ta 'replikazzjoni CSF 1 b'bidla log2 darbiet (assi x) relattiva għall-valur P statistiku -log10 bejn iż-żewġ sottogruppi AsymAD. Il-bijomarkaturi tal-pannelli huma kkuluriti. (E) Replikazzjoni CSF 1 livell ta 'abbundanza tal-bijomarkaturi tal-grupp ta' għażla huma espressi b'mod differenzjali bejn is-sottogruppi AsymAD. L-analiżi tal-varjanza post-aġġustata ta' Tukey intużat biex tiġi vvalutata s-sinifikat statistiku.
Aħna eżaminajna l-espressjoni differenzjali tal-proteini bejn dawn il-każijiet ta 'kontroll u AsymAD bħal AD (Figura 6D u Tabella S2L). Il-mappa tal-vulkan li tirriżulta turi li 14-il markatur tal-pannelli nbidlu b'mod sinifikanti bejn iż-żewġ gruppi. Ħafna minn dawn il-markaturi huma membri tas-sinapsi u l-metaboloma. Madankollu, SOD1 u myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), li huma membri tal-gruppi immuni myelin u glial, rispettivament, jappartjenu wkoll għal dan il-grupp (Figura 6, D u E). Il-panel vaskulari kkontribwixxa wkoll żewġ markaturi li tnaqqsu b'mod sinifikanti fil-grupp AsymAD li jixbah lil AD, inkluż il-proteina li torbot AE 1 (AEBP1) u l-membru tal-familja C9 li jikkumplimenta. Ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti bejn il-kontroll u s-sottogruppi AsymAD li jixbħu lil AD f'ELISA AB1-42 (P = 0.38) u p-tau (P = 0.28), iżda tabilħaqq kien hemm differenza sinifikanti fil-livell tau totali (P = 0.0031). ) (Fig. S7). Hemm bosta markaturi tal-pannelli li jindikaw li l-bidliet bejn iż-żewġ sottogruppi AsymAD huma aktar sinifikanti mil-livelli totali tau (per eżempju, YWHAZ, SOD1 u MDH1) (Figura 6E). B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jindikaw li l-panel validat tagħna jista 'jkun fih bijomarkaturi li jistgħu sottotip u stratifikazzjoni tar-riskju potenzjali ta' pazjenti b'mard bla sintomi.
Hemm ħtieġa urġenti għal għodod tal-bijomarkaturi bbażati fuq is-sistema biex ikejlu u jimmiraw aħjar id-diversi patofiżjoloġija wara l-AD. Dawn l-għodod huma mistennija mhux biss ibiddlu l-qafas dijanjostiku tal-AD tagħna, iżda wkoll jippromwovu l-adozzjoni ta 'strateġiji ta' trattament effettivi u speċifiċi għall-pazjent (1, 2). Għal dan il-għan, applikajna approċċ ta 'proteomics komprensiv imparzjali għall-moħħ AD u s-CSF biex jidentifikaw bijomarkaturi CSF bbażati fuq il-web li jirriflettu firxa wiesgħa ta' patofiżjoloġija bbażata fuq il-moħħ. L-analiżi tagħna pproduċiet ħames pannelli tal-bijomarkaturi tas-CSF, li (i) jirriflettu sinapsi, vini tad-demm, myelin, disfunzjoni immuni u metabolika; (ii) juri riproduċibbiltà qawwija fuq pjattaformi ta' SM differenti; (iii) Uri bidliet progressivi speċifiċi għall-mard matul l-istadji bikrija u tard ta' AD. B'mod ġenerali, dawn is-sejbiet jirrappreżentaw pass promettenti lejn l-iżvilupp ta 'għodod ta' bijomarkaturi diversi, affidabbli u orjentati lejn il-web għar-riċerka AD u applikazzjonijiet kliniċi.
Ir-riżultati tagħna juru l-organizzazzjoni kkonservata ħafna tal-proteoma tan-netwerk tal-moħħ AD u jappoġġaw l-użu tiegħu bħala ankra għall-iżvilupp tal-bijomarkatur ibbażat fuq is-sistema. L-analiżi tagħna turi li żewġ settijiet tad-dejta TMT-MS indipendenti li fihom imħuħ AD u AsymAD għandhom modularità qawwija. Dawn is-sejbiet jestendu x-xogħol preċedenti tagħna, u juru l-preservazzjoni tal-moduli qawwija ta 'aktar minn 2,000 tessut tal-moħħ minn koorti indipendenti multipli fil-kortiċi frontali, parietali u temporali (17). Dan in-netwerk ta 'kunsens jirrifletti diversi bidliet relatati mal-mard osservati fir-riċerka attwali, inkluża ż-żieda ta' moduli infjammatorji b'ħafna glial u t-tnaqqis ta 'moduli sinjuri fin-newroni. Bħar-riċerka attwali, dan in-netwerk fuq skala kbira għandu wkoll bidliet modulari sinifikanti f'AsymAD, li juri varjetà ta 'patofiżjoloġija preklinika differenti (17).
Madankollu, fi ħdan dan il-qafas konservattiv ħafna bbażat fuq is-sistema, hemm eteroġeneità bijoloġika aktar fina, speċjalment fost individwi fl-istadji bikrija ta 'AD. Il-pannell tal-bijomarkaturi tagħna huwa kapaċi juri żewġ sottogruppi f'AsymAD, li juru l-espressjoni differenzjali sinifikanti ta 'markaturi CSF multipli. Il-grupp tagħna kien kapaċi jenfasizza d-differenzi bijoloġiċi bejn dawn iż-żewġ sottogruppi, li ma kinux ovvji fil-livell tal-bijomarkaturi ewlenin tal-AD. Meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, il-proporzjonijiet Aβ1-42/tau totali ta' dawn l-individwi AsymAD kienu baxxi b'mod anormali. Madankollu, il-livelli totali tau biss kienu differenti b'mod sinifikanti bejn iż-żewġ sottogruppi AsymAD, filwaqt li l-livelli Aβ1-42 u p-tau baqgħu relattivament komparabbli. Peress li tau għoli ta 'CSF jidher li huwa tbassir aħjar tas-sintomi konjittivi minn livelli Aβ1-42 (7), nissuspettaw li ż-żewġ koorti AsymAD jista' jkollhom riskji differenti ta 'progressjoni tal-marda. Minħabba d-daqs limitat tal-kampjun ta 'l-AsymAD tagħna u n-nuqqas ta' dejta lonġitudinali, hija meħtieġa aktar riċerka biex b'mod kunfidenti jinġibdu dawn il-konklużjonijiet. Madankollu, dawn ir-riżultati jindikaw li panel tas-CSF ibbażat fuq is-sistema jista 'jtejjeb il-kapaċità tagħna li nistratifikaw b'mod effettiv l-individwi matul l-istadju asintomatiku tal-marda.
B'mod ġenerali, is-sejbiet tagħna jappoġġjaw ir-rwol ta 'funzjonijiet bijoloġiċi multipli fil-patoġenesi ta' AD. Madankollu, il-metaboliżmu tal-enerġija disregolat sar it-tema prominenti tal-ħames pannelli ta 'tikkettar validati tagħna kollha. Proteini metaboliċi, bħal hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) u lactate dehydrogenase A (LDHA), huma l-bijomarkaturi sinaptiċi l-aktar validati b'mod robust, li jindikaw li ż-żieda fl-AD CSF hija sess riproduċibbli ħafna. Il-vini u l-pannelli glial tagħna fihom ukoll bosta markaturi involuti fil-metaboliżmu ta 'sustanzi ossidattivi. Dawn is-sejbiet huma konsistenti mar-rwol ewlieni li l-proċessi metaboliċi għandhom fil-moħħ kollu, mhux biss biex jissodisfaw id-domanda għolja għall-enerġija tan-newroni, iżda wkoll biex jissodisfaw id-domanda għolja għall-enerġija ta 'astroċiti u ċelluli glial oħra (17, 48). Ir-riżultati tagħna jappoġġjaw evidenza dejjem tikber li l-bidliet fil-potenzjal redox u l-interruzzjoni tal-mogħdijiet tal-enerġija jistgħu jkunu r-rabta ewlenija bejn bosta proċessi ewlenin involuti fil-patoġenesi tal-AD, inklużi disturbi mitokondrijali, infjammazzjoni medjata mill-glial u ħsara vaskulari (49). Barra minn hekk, il-bijomarkaturi metaboliċi tal-fluwidu ċerebrospinali fihom numru kbir ta 'proteini sinjuri b'mod differenzjali bejn il-kontroll tagħna u s-sottogruppi AsymAD li jixbhu l-AD, li jissuġġerixxu li t-tfixkil ta' dawn il-mogħdijiet ta 'enerġija u redox jista' jkun kritiku fl-istadju prekliniku tal-marda.
It-tendenzi differenti tal-pannelli tal-moħħ u tal-fluwidu ċerebrospinali li osservajna għandhom ukoll implikazzjonijiet bijoloġiċi interessanti. Sinapsi u metabolomi sinjuri fin-newroni juru livelli mnaqqsa fil-moħħ AD u abbundanza akbar fil-fluwidu ċerebrospinali. Minħabba li n-newroni huma sinjuri fil-mitokondrija li jipproduċu l-enerġija fis-sinapsi biex jipprovdu enerġija għas-sinjali speċjalizzati numerużi tagħhom (50), ix-xebh tal-profili ta 'espressjoni ta' dawn iż-żewġ gruppi ta 'newroni huwa mistenni. It-telf ta 'newroni u l-estrużjoni ta' ċelluli bil-ħsara jistgħu jispjegaw dawn ix-xejriet tal-pannelli tal-moħħ u tas-CSF f'mard aktar tard, iżda ma jistgħux jispjegaw il-bidliet bikrija tal-pannelli li nosservaw (13). Spjegazzjoni waħda possibbli għal dawn is-sejbiet f'mard asintomatiku bikri hija żbir sinaptiku anormali. Evidenza ġdida f'mudelli tal-ġrieden tissuġġerixxi li l-fagoċitosi sinaptika medjata mill-mikroglia tista 'tiġi attivata b'mod anormali fl-AD u twassal għal telf bikri tas-sinapsi fil-moħħ (51). Dan il-materjal sinaptiku mormi jista 'jakkumula fis-CSF, u huwa għalhekk li nosservaw iż-żieda fis-CSF fil-pannell tan-newroni. Iż-żbir sinaptiku medjat mill-immunità jista 'wkoll jispjega parzjalment iż-żieda fil-proteini gliali li nosservaw fil-moħħ u l-fluwidu ċerebrospinali matul il-proċess tal-marda. Minbarra żbir sinaptiku, anormalitajiet ġenerali fil-mogħdija eżoċitika jistgħu jwasslu wkoll għal espressjonijiet differenti tal-moħħ u CSF ta 'markaturi newronali. Numru ta 'studji wrew li l-kontenut ta' exosomes fil-patoġenesi tal-moħħ AD inbidel (52). Il-mogħdija extraċellulari hija wkoll involuta fil-proliferazzjoni ta 'Aβ (53, 54). Ta 'min jinnota li s-soppressjoni ta' sekrezzjoni eżosomali tista 'tnaqqas il-patoloġija bħal AD f'mudelli ta' ġrieden transġeniċi AD (55).
Fl-istess ħin, il-proteina fil-pannell vaskulari wriet żieda moderata fil-moħħ AD, iżda naqset b'mod sinifikanti fis-CSF. Id-disfunzjoni tal-barriera tad-demm u l-moħħ (BBB) tista 'tispjega parzjalment dawn is-sejbiet. Bosta studji indipendenti fuq il-bniedem wara l-mewt urew it-tqassim tal-BBB f'AD (56, 57). Dawn l-istudji kkonfermaw diversi attivitajiet anormali madwar dan is-saff issiġillat sewwa ta 'ċelluli endoteljali, inkluż tnixxija kapillari tal-moħħ u akkumulazzjoni perivaskulari ta' proteini li jinġarru mid-demm (57). Dan jista 'jipprovdi spjegazzjoni sempliċi għall-proteini vaskulari elevati fil-moħħ, iżda ma jistax jispjega bis-sħiħ it-tnaqqis ta' dawn l-istess proteini fil-fluwidu ċerebrospinali. Possibbiltà waħda hija li s-sistema nervuża ċentrali qed tiżola b'mod attiv dawn il-molekuli biex issolvi l-problema ta 'żieda fl-infjammazzjoni u stress ossidattiv. It-tnaqqis f'xi wħud mill-proteini CSF l-aktar severi f'dan il-panel, speċjalment dawk involuti fir-regolamentazzjoni tal-lipoproteini, huwa relatat mal-inibizzjoni ta 'livelli ta' ħsara ta 'infjammazzjoni u l-proċess newroprotettiv ta' speċi reattivi ta 'ossiġnu. Dan jgħodd għal Paroxonase 1 (PON1), enzima li torbot lil lipoproteini responsabbli biex tnaqqas il-livelli ta 'stress ossidattiv fiċ-ċirkolazzjoni (58, 59). Alpha-1-microglobulin/bikunin prekursur (AMBP) huwa markatur ieħor irregolat b'mod sinifikanti 'l isfel tal-grupp vaskulari. Huwa l-prekursur tat-trasportatur tal-lipidi bikunin, li huwa wkoll involut fit-trażżin tal-infjammazzjoni u l-Protezzjoni newroloġika (60, 61).
Minkejja diversi ipoteżijiet interessanti, l-inabbiltà li jinstabu direttament mekkaniżmi ta 'mard bijokimiku hija limitazzjoni magħrufa sew ta' analiżi proteomika mmexxija mill-iskoperta. Għalhekk, aktar riċerka hija meħtieġa biex tiddefinixxi b'mod kunfidenti l-mekkaniżmi wara dawn il-pannelli tal-bijomarkaturi. Sabiex nimxu lejn l-iżvilupp ta’ analiżi klinika bbażata fuq l-SM, id-direzzjoni futura teħtieġ ukoll l-użu ta’ metodi kwantitattivi mmirati għall-verifika tal-bijomarkaturi fuq skala kbira, bħal monitoraġġ selettiv jew parallel ta’ reazzjoni (62). Riċentement użajna monitoraġġ tar-reazzjoni parallela (63) biex nivvalidaw ħafna mill-bidliet fil-proteini CSF deskritti hawn. Diversi miri tal-pannelli ta 'prijorità huma kkwantifikati bi preċiżjoni sinifikanti, inklużi YWHAZ, ALDOA, u SMOC1, li jimmappaw mal-pannelli tas-sinapsi, tal-metaboliżmu u tal-infjammazzjoni tagħna, rispettivament (63). L-Akkwist Indipendenti tad-Dejta (DIA) u strateġiji oħra bbażati fuq l-SM jistgħu wkoll ikunu utli għall-verifika fil-mira. Bud et al. (64) Dan l-aħħar intwera li hemm koinċidenza sinifikanti bejn il-bijomarkaturi AD identifikati fis-sett tad-dejta tal-iskoperta tas-CSF tagħna u s-sett tad-dejta indipendenti DIA-MS, li jikkonsisti fi kważi 200 kampjun CSF minn tliet koorti Ewropej differenti. Dawn l-istudji reċenti jappoġġjaw il-potenzjal tal-pannelli tagħna biex jittrasformaw f'detezzjoni affidabbli bbażata fuq l-SM. Is-sejbien tradizzjonali tal-antikorpi u l-aptamers huma importanti wkoll għall-iżvilupp ulterjuri tal-bijomarkaturi ewlenin tal-AD. Minħabba l-abbundanza baxxa ta 'CSF, huwa aktar diffiċli li jinstabu dawn il-bijomarkaturi bl-użu ta' metodi MS b'rendiment għoli. NEFL u NRGN huma żewġ eżempji bħal dawn ta 'bijomarkaturi CSF ta' abbundanza baxxa, li huma mmappjati mal-panel fl-analiżi komprensiva tagħna, iżda ma jistgħux jiġu skoperti b'mod affidabbli bl-użu tal-istrateġija tal-MS unika tagħna. Strateġiji ta' mira bbażati fuq antikorpi multipli, bħall-PEA, jistgħu jippromwovu t-trasformazzjoni klinika ta' dawn il-markaturi.
B'mod ġenerali, dan l-istudju jipprovdi approċċ proteomika uniku għall-identifikazzjoni u l-verifika ta 'bijomarkaturi CSF AD bbażati fuq sistemi differenti. L-ottimizzazzjoni ta’ dawn il-pannelli tal-markaturi f’koorti AD addizzjonali u pjattaformi MS tista’ tkun promettenti biex tavvanza l-istratifikazzjoni u t-trattament tar-riskju tal-AD. Studji li jevalwaw il-livell lonġitudinali ta 'dawn il-pannelli matul iż-żmien huma wkoll kritiċi biex jiddeterminaw liema kombinazzjoni ta' markaturi tistratifika l-aħjar ir-riskju ta 'mard bikri u bidliet fis-severità tal-marda.
Ħlief għat-3 kampjuni kkupjati minn CSF, il-kampjuni kollha CSF użati f'dan l-istudju nġabru taħt l-awspiċi ta 'Emory ADRC jew istituzzjonijiet ta' riċerka relatati mill-qrib. B'kollox intużaw erba' settijiet ta' kampjuni ta' Emory CSF f'dawn l-istudji tal-proteomika. Il-koorti tas-CSF instab li kien fih kampjuni minn 20 kontroll b'saħħtu u 20 pazjent AD. Il-kopja 1 tas-CSF tinkludi kampjuni minn 32 kontroll b'saħħtu, 31 individwu AsymAD, u 33 individwu AD. Il-kopja CSF 2 fiha 147 kontroll u 150 kampjun AD. Il-koorti ta' replikazzjoni CSF b'ħafna mard 4 inkludiet 18-il kontroll, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, u 11-il kampjun FTD. Skont il-ftehim approvat mill-Bord ta 'Reviżjoni Istituzzjonali tal-Università ta' Emory, il-parteċipanti kollha fl-istudju Emory kisbu kunsens infurmat. Skont il-Linji Gwida tal-Aħjar Prattika tal-Istitut Nazzjonali tal-Aging tal-2014 għaċ-Ċentri tal-Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), il-fluwidu ċerebrospinali inġabar u nħażen permezz ta 'titqib lumbari. Kontroll u pazjenti AsymAD u AD irċevew valutazzjoni konjittiva standardizzata f'Emory Cognitive Neurology Clinic jew Goizueta ADRC. Il-kampjuni tal-fluwidu ċerebrospinali tagħhom ġew ittestjati minn INNO-BIA AlzBio3 Luminex għal ELISA Aβ1-42, analiżi totali tau u p-tau (65). Il-valuri ELISA jintużaw biex jappoġġjaw il-klassifikazzjoni dijanjostika tas-suġġetti bbażati fuq kriterji ta’ qtugħ tal-bijomarkatur AD stabbiliti (66, 67). Dejta demografika u dijanjostika bażika għal dijanjosi CSF oħra (FTD, ALS, u PD) tinkiseb ukoll minn Emory ADRC jew istituzzjonijiet ta’ riċerka affiljati. Il-metadejta tal-każ fil-qosor għal dawn il-każijiet Emory CSF tista' tinstab fit-Tabella S1A. Il-karatteristiċi tal-koorti Swiss CSF replication 3 ġew ippubblikati qabel (45).
CSF sab il-kampjun. Sabiex jiżdied il-fond tal-iskoperta tagħna tas-sett tad-dejta CSF, sar konsum immuni ta 'proteini b'abbundanza għolja qabel it-tripsinizzazzjoni. Fil-qosor, 130 μl ta' CSF minn 40 kampjun individwali ta' CSF u volum ugwali (130 μl) ta' High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) tqiegħdu f'kolonna spin (Thermo Fisher Scientific, A89868) fil-kamra. temperatura Inkuba). Wara li ddur għal 15-il minuta, iċċentrifuga l-kampjun f'1000g għal 2 minuti. Apparat ta 'filtru ultraċentrifugali 3K (Millipore, UFC500396) intuża biex jikkonċentra l-kampjun tal-effluwent billi jiġi ċentrifugat f'14,000g għal 30 minuta. Iddilwixxi l-volumi kollha tal-kampjuni għal 75 μl b'salina buffered fosfat. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet evalwata bil-metodu tal-aċidu bicinchoninic (BCA) skont il-protokoll tal-manifattur (Thermo Fisher Scientific). Is-CSF immunodeplet (60 μl) mill-40 kampjun kollu ġie diġerit b'lysyl endopeptidase (LysC) u trypsin. Fil-qosor, il-kampjun ġie mnaqqas u alkylated b'1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine u 3 μl 0.8 M chloroacetamide f'90 ° C għal 10 minuti, u mbagħad ivvibrat f'banju ta 'l-ilma għal 15-il minuta. Il-kampjun ġie dilwit b'193 μl 8 M urea buffer [8 M urea u 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] għal konċentrazzjoni finali ta '6 M urea. LysC (4.5 μg; Wako) jintuża għad-diġestjoni matul il-lejl f'temperatura tal-kamra. Il-kampjun imbagħad ġie dilwit għal 1 M urea b'50 mM bikarbonat tal-ammonju (ABC) (68). Żid ammont ugwali (4.5 μg) ta’ trypsin (Promega), u mbagħad inkuba l-kampjun għal 12-il siegħa. Aċidifika s-soluzzjoni ta' peptide diġerit għal konċentrazzjoni finali ta' 1% aċidu formiku (FA) u 0.1% aċidu trifluworoaċetiku (TFA) (66), u mbagħad neħħi l-melħ b'kolonna Sep-Pak C18 ta' 50 mg (Ilmijiet) kif deskritt hawn fuq (25) . Il-peptide mbagħad ġie eluwit f'1 ml ta' 50% acetonitrile (ACN). Biex tistandardizza l-kwantifikazzjoni tal-proteini fuq lottijiet (25), 100 μl alikwoti mill-40 kampjun CSF kollha ġew magħquda biex jiġġeneraw kampjun imħallat, li mbagħad ġie maqsum f'ħames kampjuni ta 'standard intern globali (GIS) (48). Il-kampjuni individwali kollha u l-istandards magħquda huma mnixxfa b'vakwu b'veloċità għolja (Labconco).
CSF tikkopja l-kampjun. Dayon u l-kollegi qabel iddeskrivew it-tnaqqis immuni u d-diġestjoni tal-kampjuni tal-kopja CSF 3 (45, 46). Il-kampjuni replikati li kien fadal ma kinux immunodepletjati individwalment. Iddiġerixxi dawn il-kampjuni mhux imneħħija fi trypsin kif deskritt qabel (17). Għal kull analiżi ripetuta, 120 μl alikwoti tal-peptide eluwit minn kull kampjun ġew miġbura flimkien u maqsuma f'alikwoti ta' volum ugwali biex jintużaw bħala l-istandard intern globali tikkettat bit-TMT (48). Il-kampjuni individwali kollha u l-istandards magħquda huma mnixxfa b'vakwu b'veloċità għolja (Labconco). Sabiex jittejjeb is-sinjal tal-proteina CSF b'abbundanza baxxa, billi tgħaqqad 125 μl minn kull kampjun, ġie ppreparat kampjun "mtejjeb" għal kull analiżi replika [jiġifieri, kampjun bijoloġiku li jimita l-kampjun tar-riċerka, iżda l-ammont disponibbli huwa ħafna akbar (37, 69)] magħquda f'kampjun imħallat CSF (17). Il-kampjun imħallat imbagħad tneħħa immunomod bl-użu ta '12 ml ta' High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), diġerit kif deskritt hawn fuq, u inkluż fit-tikkettar TMT multiplu sussegwenti.
Ħin tal-post: Awissu-27-2021