Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
It-termofili huma mikro-organiżmi li jirnexxu f'temperaturi għoljin. L-istudju tagħhom jista 'jipprovdi informazzjoni siewja dwar kif il-ħajja tadatta għal kundizzjonijiet estremi. Madankollu, huwa diffiċli li jinkisbu kundizzjonijiet ta 'temperatura għolja b'mikroskopji ottiċi konvenzjonali. Ġew proposti diversi soluzzjonijiet magħmula mid-dar ibbażati fuq tisħin elettriku reżistenti lokali, iżda m'hemm l-ebda soluzzjoni kummerċjali sempliċi. F'dan id-dokument, nintroduċu l-kunċett ta 'tisħin bil-lejżer mikroskala fuq il-kamp ta' viżjoni tal-mikroskopju biex nipprovdu temperaturi għoljin għal studji termofili filwaqt li nżommu l-ambjent tal-utent ħafif. It-tisħin fuq mikroskala f'intensità moderata tal-lejżer jista 'jinkiseb bl-użu ta' sottostrat miksi b'nanopartiċelli tad-deheb bħala assorbatur tad-dawl bijokompatibbli u effiċjenti. Effetti possibbli tal-konvezzjoni tal-fluwidu fuq mikroskala, iż-żamma taċ-ċelluli, u l-moviment termoforetiku ċentrifugali huma diskussi. Il-metodu ġie muri f'żewġ speċi: (i) Geobacillus stearothermophilus, batterju termofiliku attiv li jirriproduċi f'madwar 65°C, li osservajna li jiġġermina, jikber u jgħum taħt tisħin fuq mikroskala; (ii) Thiobacillus sp., arkaea ipertermofilika bl-aħjar mod. fi 80°C. Dan ix-xogħol iwitti t-triq għal osservazzjoni sempliċi u sigura ta 'mikro-organiżmi termofiliċi bl-użu ta' għodod ta 'mikroskopija moderni u affordabbli.
Matul biljuni ta’ snin, il-ħajja fid-Dinja evolviet biex tadatta għal firxa wiesgħa ta’ kundizzjonijiet ambjentali li kultant jitqiesu estremi mill-perspettiva umana tagħna. B'mod partikolari, xi mikro-organiżmi termofiliċi (batterji, archaea, fungi) imsejħa termofili jirnexxu fil-medda tat-temperatura minn 45 ° C sa 122 ° C1, 2, 3, 4. Termofili jgħixu f'diversi ekosistemi, bħal ventijiet idrotermali tal-baħar fond, hot springs jew żoni vulkaniċi. Ir-riċerka tagħhom ġġenerat ħafna interess matul dawn l-aħħar deċennji għal mill-inqas żewġ raġunijiet. L-ewwel, nistgħu nitgħallmu minnhom, pereżempju, kif termofili 5, 6, enżimi 7, 8 u membrani 9 huma stabbli f'temperaturi daqshekk għoljin, jew kif termofili jistgħu jifilħu livelli estremi ta 'radjazzjoni10. It-tieni, huma l-bażi għal ħafna applikazzjonijiet bijoteknoloġiċi importanti1,11,12 bħall-produzzjoni tal-fjuwil13,14,15,16, sintesi kimika (dihydro, alkoħols, metanu, aċidi amminiċi, eċċ.)17, biomining18 u bijokatalizzaturi termostabbli7 ,11, 13. B'mod partikolari, ir-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR)19 magħrufa bħalissa tinvolvi enzima (Taq polymerase) iżolata mill-batterju termofiliku Thermus aquaticus, wieħed mill-ewwel termofili li ġew skoperti.
Madankollu, l-istudju tat-termofili mhuwiex kompitu faċli u ma jistax jiġi improvizzat fl-ebda laboratorju bijoloġiku. B'mod partikolari, termofili ħajjin ma jistgħux jiġu osservati in vitro b'xi mikroskopju tad-dawl standard, anke bi kmamar tat-tisħin disponibbli kummerċjalment, ġeneralment klassifikati għal temperaturi baxxi sa 40 ° C. Sa mis-snin 90, ftit gruppi ta 'riċerka biss iddedikaw lilhom infushom għall-introduzzjoni ta' sistemi ta 'mikroskopija b'temperatura għolja (HTM). Fl-1994 Glukh et al. Il-kamra tat-tisħin/tkessiħ ġiet imfassla abbażi tal-użu ta 'ċellula Peltier li tikkontrolla t-temperatura tal-kapillari rettangolari magħluqa biex iżżomm l-anerobija 20 . L-apparat jista 'jissaħħan sa 100 °C b'rata ta' 2 °C/s, li jippermetti lill-awturi jistudjaw il-motilità tal-batterju ipertermofiliku Thermotoga maritima21. Fl-1999 Horn et al. Ġie żviluppat apparat simili ħafna, għadu bbażat fuq l-użu ta 'kapillari msaħħna adattati għall-mikroskopija kummerċjali biex tistudja d-diviżjoni/konnessjoni taċ-ċelluli. Wara perjodu twil ta 'inattività relattiva, it-tfittxija għal HTMs effettivi reġgħet bdiet fl-2012, b'mod partikolari b'rabta ma' serje ta 'karti mill-grupp Wirth li uża apparat ivvintat minn Horn et al. Ħmistax-il sena ilu, il-motilità ta 'numru kbir ta' archaea, inklużi ipertermofili, ġiet studjata f'temperaturi sa 100 ° C bl-użu ta 'kapillari msaħħna23,24. Huma mmodifikaw ukoll il-mikroskopju oriġinali biex jiksbu tisħin aktar mgħaġġel (diversi minuti minflok 35 minuta biex jilħqu t-temperatura stabbilita) u jiksbu gradjent ta 'temperatura lineari ta' aktar minn 2 ċm madwar il-medju. Dan it-tagħmir tal-iffurmar tal-gradjent tat-temperatura (TGFD) intuża biex jistudja l-mobilità ta 'ħafna termofili fi ħdan gradjenti ta' temperatura f'distanzi bijoloġikament rilevanti 24, 25 .
It-tisħin tal-kapillari magħluqa mhuwiex l-uniku mod biex jiġu osservati termofili ħajjin. Fl-2012, Kuwabara et al. Intużaw kmamar Pyrex homemade li jintremew issiġillati b'adeżiv reżistenti għas-sħana (Super X2; Cemedine, il-Ġappun). Il-kampjuni tpoġġew fuq pjanċa tat-tisħin trasparenti disponibbli kummerċjalment (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, il-Ġappun) li kapaċi tissaħħan sa 110 ° C, iżda mhux maħsuba oriġinarjament għall-bijoimmaġni. L-awturi osservaw diviżjoni effiċjenti ta 'batterji termofiliċi anerobiċi (Thermosipho globiformans, irduppjar ħin 24 min) f'65 ° C. Fl-2020, Pulshen et al. Tisħin effiċjenti ta 'platti tal-metall kummerċjali (AttofluorTM, Thermofisher) intwera bl-użu ta' żewġ elementi ta 'tisħin magħmulin mid-dar: għatu u stadju (konfigurazzjoni ispirata mill-magni PCR). Din l-assoċjazzjoni tirriżulta f'temperatura uniformi tal-likwidu u tipprevjeni l-evaporazzjoni u l-kondensazzjoni fil-qiegħ tal-għatu. L-użu ta 'O-ring jevita l-iskambju tal-gass mal-ambjent. Dan l-HTM, imsejjaħ is-Sulfoscope, intuża biex jistampa Sulfolobus acidocaldarius f'75°C27.
Limitazzjoni rikonoxxuta ta 'dawn is-sistemi kollha kienet ir-restrizzjoni għall-użu ta' għanijiet ta 'l-arja, kwalunkwe immersjoni taż-żejt ma kinitx adattata għal tali temperatura għolja u għall-immaġini permezz ta' kampjuni trasparenti ta '> 1-mm ħxuna. Limitazzjoni rikonoxxuta ta 'dawn is-sistemi kollha kienet ir-restrizzjoni għall-użu ta' għanijiet ta 'l-arja, kwalunkwe immersjoni taż-żejt ma kinitx adattata għal tali temperatura għolja u għall-immaġini permezz ta' kampjuni trasparenti ta '> 1-mm ħxuna. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование воЈозем было ограничение ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температури и зало подходило для зрачные образцы толщиной > 1 мм. Nuqqas rikonoxxut ta 'dawn is-sistemi kollha kien il-limitazzjoni għall-użu ta' għanijiet ta 'l-arja, peress li kwalunkwe immersjoni taż-żejt ma kinitx adattata għal tali temperatura għolja u għall-viżwalizzazzjoni permezz ta' kampjuni trasparenti > 1 mm ħxuna.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适吘皩鿙适合物镜，任何油浸都不适吘皩忙适吘皩镜毫米厚的透明样品成像。 Limitazzjoni rikonoxxuta ta 'dawn is-sistemi kollha hija l-limitazzjoni ta' l-użu ta 'mera mdaħħla bl-arja, peress li kwalunkwe immersjoni taż-żejt mhix adattata għall-immaġni ta' kampjuni trasparenti > 1 mm ħoxnin f'temperaturi għoljin bħal dawn. Общепризнананы недостаткком вэ втих яистем является ограниченое исполззование вздушшзшшыхых о għandna и ружение в масло непригодно для таких ыысоких температур и и взуализацацацацацаии через през през през през през през през през през празцы м. Żvantaġġ rikonoxxut ta 'dawn is-sistemi kollha huwa l-użu limitat ta' lentijiet ta 'l-arja, kwalunkwe immersjoni taż-żejt mhix adattata għal temperaturi għoljin bħal dawn u viżwalizzazzjoni permezz ta' kampjuni trasparenti > 1 mm ħxuna.Aktar reċentement, din il-limitazzjoni tneħħiet minn Charles-Orzag et al. 28, li żviluppa apparat li m'għadux jipprovdi sħana madwar is-sistema ta 'interess, iżda pjuttost ġewwa l-ħġieġ ta' kopertura innifsu, miksi b'saff irqiq trasparenti ta 'reżistenza magħmul minn ITO (ossidu tal-indium-tin). L-għatu jista 'jissaħħan sa 75 °C billi jgħaddi kurrent elettriku mis-saff trasparenti. Madankollu, l-awtur għandu wkoll isaħħan il-lenti għall-objettiv, iżda mhux aktar minn 65 °C, sabiex ma ssirx ħsara.
Dawn ix-xogħlijiet juru li l-iżvilupp ta 'mikroskopija ottika effiċjenti f'temperatura għolja ma ġiex adottat b'mod wiesa', ħafna drabi jeħtieġ tagħmir magħmul mid-dar, u ħafna drabi jinkiseb bl-ispiża tar-riżoluzzjoni spazjali, li huwa żvantaġġ serju minħabba li l-mikro-organiżmi termofiliċi mhumiex akbar minn ftit. mikrometri. Volum ta' tisħin imnaqqas huwa ċ-ċavetta biex jissolvew tliet problemi inerenti tal-HTM: riżoluzzjoni spazjali fqira, inerzja termali għolja meta s-sistema tissaħħan, u tisħin ta' ħsara tal-elementi tal-madwar (żejt tal-immersjoni, lenti oġġettiva... jew idejn tal-utent) f'temperaturi estremi. ).
F'dan id-dokument, nintroduċu HTM għall-osservazzjoni termofila li mhix ibbażata fuq tisħin reżistenti. Minflok, ksibna tisħin lokalizzat f'reġjun limitat tal-kamp viżiv tal-mikroskopju permezz ta 'irradjazzjoni bil-lejżer ta' sottostrat li jassorbi d-dawl. Id-distribuzzjoni tat-temperatura ġiet viżwalizzata bl-użu ta' mikroskopija tal-fażi kwantitattiva (QPM). L-effettività ta 'dan il-metodu hija murija minn Geobacillus stearothermophilus, batterju termofiliku mobbli li jirriproduċi f'madwar 65 ° C u għandu ħin qasir ta' rduppjar (madwar 20 minuta), u Sulfolobus shibatae, ipertermofilu li jikber bl-aħjar mod f'80 ° C (archaea) biex turi. Ir-rata ta 'replikazzjoni normali u l-għawm kienu osservati bħala funzjoni tat-temperatura. Dan il-lejżer HTM (LA-HTM) mhuwiex limitat mill-ħxuna tal-coverslip jew min-natura tal-għan (immersjoni bl-arja jew taż-żejt). Dan jippermetti li tintuża kwalunkwe lenti ta' riżoluzzjoni għolja fis-suq. Ma jbatix ukoll minn tisħin bil-mod minħabba inerzja termali (jikseb tisħin immedjat fuq skala millisekondi) u juża biss komponenti disponibbli kummerċjalment. L-uniku tħassib ġdid dwar is-sikurezza huwa relatat mal-preżenza ta 'raġġi tal-lejżer b'saħħithom (tipikament sa 100 mW) ġewwa l-apparat u possibilment mill-għajnejn, li jeħtieġu gogils protettivi.
Il-prinċipju ta 'LA-HTM huwa li tuża laser biex issaħħan il-kampjun lokalment fil-kamp viżiv tal-mikroskopju (Fig. 1a). Biex tagħmel dan, il-kampjun għandu jassorbi d-dawl. Biex tuża qawwa tal-lejżer raġonevoli (inqas minn 100 mW), aħna ma bbażajnax fuq l-assorbiment tad-dawl mill-mezz likwidu, iżda żiedet artifiċjalment l-assorbiment tal-kampjun billi kisi s-sottostrat b'nanopartiċelli tad-deheb (Fig. 1c). It-tisħin tan-nanopartiċelli tad-deheb bid-dawl huwa ta 'importanza fundamentali għall-qasam tal-plasmonics termali, b'applikazzjonijiet mistennija fil-bijomediċina, nanokimika jew ħsad tad-dawl tax-xemx29,30,31. Matul l-aħħar ftit snin, użajna dan LA-HTM f'diversi studji relatati ma 'applikazzjonijiet tal-plażma termali fil-fiżika, il-kimika u l-bijoloġija. Id-diffikultà ewlenija ma 'dan il-metodu hija fil-wiri tal-profil tat-temperatura finali, peress li t-temperatura elevata hija limitata għal reġjun mikroskala fil-kampjun. Aħna wrejna li l-immappjar tat-temperatura jista 'jinkiseb bl-interferometru shear trasversali b'erba' tul ta 'mewġ, metodu sempliċi, b'riżoluzzjoni għolja u sensittiv ħafna ta' mikroskopija ta 'fażi kwantitattiva bbażat fuq l-użu ta' gradilji ta 'diffrazzjoni bidimensjonali (magħrufa wkoll bħala cross gratings) 33,34,35,36. L-affidabbiltà ta 'din it-teknika ta' mikroskopija termali, ibbażata fuq mikroskopija tal-mewġ tal-ħakk imqassam (CGM), intweriet f'tużżana karti ppubblikati matul l-aħħar għaxar snin37,38,39,40,41,42,43.
Skema ta 'installazzjoni ta' mikroskopju parallel ta 'tisħin, iffurmar u temperatura. b Ġeometrija tal-kampjun li tikkonsisti f'kamra AttofluorTM li fiha coverslip miksi b'nanopartiċelli tad-deheb. c Ħares mill-qrib lejn il-kampjun (mhux fuq skala). d jirrappreżenta l-profil uniformi tar-raġġ tal-lejżer u (e) id-distribuzzjoni tat-temperatura sussegwenti simulata fuq il-pjan tal-kampjun tan-nanopartiċelli tad-deheb. f huwa profil tar-raġġ tal-lejżer annulari adattat biex jiġġenera temperatura uniformi kif muri fis-simulazzjoni tad-distribuzzjoni tat-temperatura li tirriżulta murija f'(g). Skala bar: 30 µm.
B'mod partikolari, reċentement ksibna tisħin ta 'ċelluli mammiferi b'LA-HTM u CGM u ssegwi r-risponsi ta' xokk tas-sħana ċellulari fil-medda ta '37-42 ° C, u wera l-applikabilità ta' din it-teknika għal immaġini ta 'ċellula ħajja waħda. Madankollu, l-applikazzjoni ta 'LA-HTM għall-istudju tal-mikro-organiżmi f'temperaturi għoljin mhijiex ċara, peress li teħtieġ aktar kawtela meta mqabbla ma' ċelloli tal-mammiferi: l-ewwelnett, it-tisħin tal-qiegħ tal-medju b'għexieren ta 'gradi (aktar milli ftit gradi) iwassal għal gradjent qawwi ta' temperatura vertikali. jista 'joħloq konvezzjoni fluwidu 44 li, jekk mhux imwaħħla sew mas-sottostrat, tista' tikkawża moviment mhux mixtieq u taħlit ta 'batterji. Din il-konvezzjoni tista 'tiġi eliminata billi titnaqqas il-ħxuna tas-saff likwidu. Għal dan il-għan, fl-esperimenti kollha ppreżentati hawn taħt, tqiegħdu sospensjonijiet batterjali bejn żewġ coverslips ta 'madwar 15 µm ħoxnin imqiegħda ġewwa tazza tal-metall (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b, c). Fil-prinċipju, il-konvezzjoni tista 'tiġi evitata jekk il-ħxuna tal-likwidu hija iżgħar mid-daqs tar-raġġ tal-laser tat-tisħin. It-tieni nett, ix-xogħol f'ġeometrija daqshekk limitata jista' jifga organiżmi aerobiċi (ara Fig. S2). Din il-problema tista 'tiġi evitata bl-użu ta' sottostrat li huwa permeabbli għall-ossiġnu (jew kwalunkwe gass vitali ieħor), billi jitħallew bżieżaq ta 'l-arja maqbuda ġewwa l-coverslip, jew billi jittaqqbu toqob fil-coverslip ta' fuq (ara Fig. S1) 45 . F'dan l-istudju, għażilna l-aħħar soluzzjoni (Figuri 1b u S1). Fl-aħħarnett, it-tisħin bil-lejżer ma jipprovdix distribuzzjoni uniformi tat-temperatura. Anke fl-istess intensità tar-raġġ tal-lejżer (Fig. 1d), id-distribuzzjoni tat-temperatura mhix uniformi, iżda pjuttost tixbaħ id-distribuzzjoni Gaussjana minħabba diffużjoni termali (Fig. 1e). Meta l-għan huwa li jiġu stabbiliti temperaturi preċiżi fil-qasam tal-vista għall-istudju ta 'sistemi bijoloġiċi, profili irregolari mhumiex ideali u jistgħu jwasslu wkoll għal moviment termoforetiku ta' batterji jekk ma jaderixxux mas-sottostrat (ara Fig. S3, S4)39. Għal dan il-għan, użajna modulatur tad-dawl spazjali (SLM) biex tifforma r-raġġ tal-lejżer infra-aħmar skont il-forma taċ-ċirku (Fig. 1f) fil-pjan tal-kampjun biex tinkiseb distribuzzjoni tat-temperatura perfettament uniformi f'żona ġeometrika partikolari, minkejja diffużjoni termali (Fig. 1d) 39 , 42, 46. Poġġi coverslip ta 'fuq fuq dixx tal-metall (Figura 1b) biex tevita l-evaporazzjoni tal-medju u osserva għal mill-inqas ftit jiem. Minħabba li dan il-coverslip ta 'fuq mhuwiex issiġillat, medju addizzjonali jista' jiġi miżjud faċilment fi kwalunkwe ħin jekk meħtieġ.
Biex nispjegaw kif jaħdem LA-HTM u nuru l-applikabilità tiegħu fir-riċerka termofilika, studjajna l-batterji aerobiċi Geobacillus stearothermophilus, li għandhom temperatura ottimali ta 'tkabbir ta' madwar 60-65 ° C. Il-batterju għandu wkoll flagella u l-abbiltà li jgħum, li jipprovdi indikatur ieħor ta 'attività ċellulari normali.
Kampjuni (Fig. 1b) ġew inkubati minn qabel f'60 ° C għal siegħa u mbagħad imqiegħda f'kontenitur tal-kampjun LA-HTM. Din l-inkubazzjoni minn qabel hija fakultattiva, iżda għadha utli, għal żewġ raġunijiet: L-ewwel, meta l-lejżer jinxtegħel, jikkawża li ċ-ċelloli jikbru u jinqasmu immedjatament (ara l-film M1 f'Materjali Supplimentari). Mingħajr pre-inkubazzjoni, it-tkabbir tal-batterja huwa tipikament ittardjat b'madwar 40 minuta kull darba li żona ġdida tal-vista tissaħħan fuq il-kampjun. It-tieni nett, il-pre-inkubazzjoni ta 'siegħa ppromwoviet l-adeżjoni tal-batterja mal-coverslip, u ppreveniet li ċ-ċelloli jitilqu mill-kamp viżiv minħabba termoforesi meta l-lejżer kien mixgħul (ara l-film M2 f'Materjali Supplimentari). Termoforesi hija l-moviment ta 'partiċelli jew molekuli tul gradjent ta' temperatura, ġeneralment minn sħun għal kiesaħ, u l-batterji mhumiex eċċezzjoni43,47. Dan l-effett mhux mixtieq jiġi eliminat fuq żona partikolari billi tuża SLM biex tifforma r-raġġ tal-lejżer u tikseb distribuzzjoni ta 'temperatura ċatta.
Fuq il-fig. Il-Figura 2 turi d-distribuzzjoni tat-temperatura mkejla minn CGM miksuba bl-irradjazzjoni ta 'sottostrat tal-ħġieġ miksi b'nanopartiċelli tad-deheb b'raġġ tal-laser annulari (Fig. 1f). Ġiet osservata distribuzzjoni ta 'temperatura ċatta fuq iż-żona kollha koperta mir-raġġ tal-lejżer. Din iż-żona ġiet issettjata għal 65 ° C, it-temperatura ottimali tat-tkabbir. Barra minn dan ir-reġjun, il-kurva tat-temperatura taqa' b'mod naturali għal \(1/r\) (fejn \(r\) hija l-koordinata radjali).
Mappa tat-temperatura ta 'kejl CGM miksub bl-użu ta' raġġ tal-laser annulari biex irradja saff ta 'nanopartiċelli tad-deheb biex jinkiseb profil ta' temperatura ċatt fuq żona ċirkolari. b Isoterma tal-mappa tat-temperatura (a). Il-kontorn tar-raġġ tal-lejżer huwa rappreżentat minn ċirku griż bit-tikek. L-esperiment ġie ripetut darbtejn (ara Materjali Supplimentari, Figura S4).
Il-vijabbiltà taċ-ċelluli batteriċi ġiet immonitorjata għal diversi sigħat bl-użu ta 'LA-HTM. Fuq il-fig. 3 juri l-intervall ta' ħin għal erba' immaġini meħuda minn film ta' 3 sigħat u 20 minuta (Film M3, Informazzjoni Supplimentari). Il-batterji kienu osservati li jipproliferaw b'mod attiv fiż-żona ċirkolari definita mill-laser fejn it-temperatura kienet ottimali, toqrob 65 ° C. B'kuntrast, it-tkabbir taċ-ċelluli tnaqqas b'mod sinifikanti meta t-temperatura niżlet taħt il-50 ° C għal 10 s.
Immaġini tal-fond ottiku ta' batterji G. stearothermophilus li qed jikbru wara tisħin bil-lejżer f'ħinijiet differenti, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, minn 200 Estratt minn film ta 'minuta (film M3 ipprovdut f'Informazzjoni Supplimentari) superimpost fuq il-mappa tat-temperatura korrispondenti. Il-lejżer jinxtegħel fil-ħin \(t=0\). Iżotermi ġew miżjuda mal-immaġni tal-intensità.
Biex tikkwantifika aktar it-tkabbir taċ-ċelluli u d-dipendenza tagħha fuq it-temperatura, kejlna ż-żieda fil-bijomassa ta 'diversi kolonji ta' batterji inizjalment iżolati fil-qasam tal-vista Movie M3 (Fig. 4). Il-batterja ġenitur magħżula fil-bidu tal-formazzjoni ta 'unità li tifforma mini kolonja (mCFU) huma murija fil-Figura S6. Ittieħdu kejl tal-massa niexfa b'kamera CGM 48 li ntużat biex tfassal id-distribuzzjoni tat-temperatura. Il-kapaċità tas-CGM li jkejjel il-piż niexef u t-temperatura hija s-saħħa tal-LA-HTM. Kif mistenni, temperatura għolja kkawżat tkabbir batterjali aktar mgħaġġel (Fig. 4a). Kif muri fil-plot semi-log fil-Fig. 4b, it-tkabbir fit-temperaturi kollha jsegwi tkabbir esponenzjali, fejn id-dejta tuża l-funzjoni esponenzjali \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), fejn \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – ħin tal-ġenerazzjoni (jew ħin ta' l-irduppjar), \( g =1/ \tau\) – rata ta' tkabbir (numru ta' diviżjonijiet għal kull unità ta' ħin ). Fuq il-fig. 4c turi r-rata tat-tkabbir rispettivi u l-ħin tal-ġenerazzjoni bħala funzjoni tat-temperatura. L-mCFU li qed jikbru malajr huma kkaratterizzati minn saturazzjoni ta 'tkabbir wara sagħtejn, imġieba mistennija minħabba densità batterjali għolja (simili għall-fażi stazzjonarja f'kulturi likwidi klassiċi). Il-forma ġenerali \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) tikkorrispondi mal-kurva mistennija f'żewġ fażijiet għal G. stearothermophilus b'rata ta 'tkabbir ottimali madwar 60-65 ° C. Qabbel id-dejta billi tuża mudell kardinali (Figura S5)49 fejn \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, li jaqbel sew ma’ valuri oħra ċċitati fil-letteratura49. Għalkemm il-parametri dipendenti fuq it-temperatura huma riproduċibbli, ir-rata massima tat-tkabbir ta' \({G}_{0}\) tista' tvarja minn esperiment għal ieħor (ara l-figuri S7-S9 u l-film M4). B'kuntrast mal-parametri tat-twaħħil tat-temperatura, li għandhom ikunu universali, ir-rata massima ta 'tkabbir tiddependi fuq il-proprjetajiet tal-medju (disponibbiltà ta' nutrijenti, konċentrazzjoni ta 'ossiġnu) fi ħdan il-ġeometrija ta' mikroskala osservata.
a Tkabbir mikrobjali f'temperaturi varji. mCFU: Unitajiet Minjaturi li jiffurmaw il-Kolonji. Dejta miksuba minn vidjo ta' batterju wieħed li qed jikber f'gradjent ta' temperatura (film M3). b L-istess bħal (a), skala semi-logaritmika. c Rata ta' tkabbir\(\tau\) u ħin ta' ġenerazzjoni\(g\) ikkalkulati minn rigressjoni lineari (b). Vireg ta 'żball orizzontali: firxa ta' temperatura li fuqha l-mCFUs espandew fil-kamp viżiv waqt it-tkabbir. Vireg ta 'żball vertikali: żball standard ta' rigressjoni lineari.
Minbarra t-tkabbir normali, xi batterji xi kultant ħarġu f'wiċċ l-ilma waqt it-tisħin bil-lejżer, li hija mġiba mistennija għal batterji bil-flagel. Il-film M5 f'informazzjoni addizzjonali juri attivitajiet ta 'għawm bħal dawn. F'dan l-esperiment, intużat radjazzjoni uniformi tal-laser biex toħloq gradjent tat-temperatura, kif muri fil-Figuri 1d, e u S3. Il-Figura 5 turi żewġ sekwenzi ta 'immaġni magħżula mill-film M5 li juru li batterju wieħed juri moviment direzzjonali filwaqt li l-batterji l-oħra kollha jibqgħu bla moviment.
Iż-żewġ perjodi ta' żmien (a) u (b) juru l-għawm ta' żewġ batterji differenti mmarkati b'ċrieki bit-tikek. L-immaġini ġew estratti mill-film M5 (provdut bħala materjal supplimentari).
Fil-każ ta 'G. stearothermophilus, il-moviment attiv tal-batterja (Fig. 5) beda ftit sekondi wara li r-raġġ tal-lejżer inxtegħel. Din l-osservazzjoni tenfasizza r-rispons temporali ta 'dan il-mikroorganiżmu termofiliku għal żieda fit-temperatura, kif diġà osservat minn Mora et al. 24 . Is-suġġett tal-motilità batterjali u anke termotassi jistgħu jiġu esplorati aktar bl-użu ta 'LA-HTM.
L-għawm mikrobjali m'għandux jiġi konfuż ma' tipi oħra ta' moviment fiżiku, jiġifieri (i) moviment Brownjan, li jidher li huwa moviment kaotiku mingħajr direzzjoni definita, (ii) konvezzjoni 50 u termoforesi 43, li tikkonsisti f'moviment regolari tul temperatura. gradjent.
G. stearothermophilus huwa magħruf għall-abbiltà tiegħu li jipproduċi spori reżistenti ħafna (formazzjoni ta 'spori) meta jkun espost għal kundizzjonijiet ambjentali ħżiena bħala difiża. Meta l-kundizzjonijiet ambjentali jerġgħu jsiru favorevoli, l-ispori jiġġerminaw, jiffurmaw ċelloli ħajjin u jerġgħu jibdew it-tkabbir. Għalkemm dan il-proċess ta' sporulazzjoni/ġerminazzjoni huwa magħruf sew, qatt ma ġie osservat f'ħin reali. Bl-użu LA-HTM, nirrapportaw hawn l-ewwel osservazzjoni ta 'avvenimenti ta' ġerminazzjoni f'G. stearothermophilus.
Fuq il-fig. 6a turi immaġini time-lapse ta 'fond ottiku (OT) miksuba bl-użu ta' sett CGM ta '13-il spor. Għall-ħin kollu tal-ġbir (15 h 6 min, \(t=0\) – il-bidu tat-tisħin bil-lejżer), 4 minn 13-il spor ġerminaw, f'punti ta' ħin suċċessivi \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' u \(11\) h \(30\)'. Għalkemm wieħed biss minn dawn l-avvenimenti jidher fil-Figura 6, 4 avvenimenti ta 'ġerminazzjoni jistgħu jiġu osservati fil-film M6 fil-materjal supplimentari. Interessanti, il-ġerminazzjoni tidher li hija każwali: mhux l-ispori kollha jiġġerminaw u ma jiġġerminawx fl-istess ħin, minkejja l-istess bidliet fil-kundizzjonijiet ambjentali.
a Time-lapse li jikkonsisti fi 8 immaġini OT (immersjoni taż-żejt, 60x, 1.25 NA għan) u (b) evoluzzjoni tal-bijomassa tal-aggregati ta' G. stearothermophilus. c (b) Miġbud fuq skala semi-log biex tenfasizza l-linearità tar-rata tat-tkabbir (linja mqabbda).
Fuq il-fig. 6b,c turi l-bijomassa tal-popolazzjonijiet taċ-ċelluli fil-qasam tal-vista bħala funzjoni taż-żmien matul il-perjodu kollu tal-ġbir tad-dejta. It-tħassir mgħaġġel tal-massa niexfa osservata fi \(t=5\)h fil-fig. 6b, c, minħabba l-ħruġ ta 'xi ċelloli mill-kamp viżiv. Ir-rata ta' tkabbir ta' dawn l-erba' avvenimenti hija \(0.77\pm 0.1\) h-1. Dan il-valur huwa ogħla mir-rata tat-tkabbir assoċjata mal-Figura 3. 3 u 4, fejn iċ-ċelloli jikbru b'mod normali. Ir-raġuni għaż-żieda fir-rata ta 'tkabbir ta' G. stearothermophilus mill-ispori mhix ċara, iżda dawn il-kejl jenfasizzaw l-interess ta 'LA-HTM u jaħdmu fil-livell ta' ċellula waħda (jew fil-livell ta 'mCFU uniku) biex jitgħallmu aktar dwar id-dinamika tal-ħajja taċ-ċelluli. .
Biex nuru aktar il-versatilità ta 'LA-HTM u l-prestazzjoni tiegħu f'temperaturi għoljin, eżaminajna t-tkabbir ta' Sulfolobus shibatae, archaea aċidofila ipertermofilika b'temperatura ottimali ta 'tkabbir ta' 80 ° C51. Meta mqabbla ma 'G. stearothermophilus, dawn l-archaea għandhom ukoll morfoloġija differenti ħafna, li jixbħu sferi ta' 1 mikron (cocci) aktar milli vireg tawwali (baċilli).
Il-Figura 7a tikkonsisti f'immaġini sekwenzjali tal-fond ottiku ta 'S. shibatae mCFU miksuba bl-użu ta' CGM (ara l-film karatteristika M7 f'Materjali Supplimentari). Dan l-mCFU jikber f'madwar 73 ° C, taħt it-temperatura ottima ta '80 ° C, iżda fil-medda tat-temperatura għal tkabbir attiv. Aħna osservajna diversi avvenimenti ta 'fissjoni li għamlu mCFUs jidhru qishom mikrogħeneb ta' archaea wara ftit sigħat. Minn dawn l-immaġini OT, il-bijomassa mCFU ġiet imkejla maż-żmien u ppreżentata fil-Figura 7b. Interessanti, S. shibatae mCFUs wera tkabbir lineari aktar milli t-tkabbir esponenzjali li deher b'mCFUs ta 'G. stearothermophilus. Kien hemm diskussjoni fit-tul 52 dwar in-natura tar-rati tat-tkabbir taċ-ċelluli: filwaqt li xi studji jirrappurtaw rati ta’ tkabbir ta’ mikrobi li huma proporzjonali għad-daqs tagħhom (tkabbir esponenzjali), oħrajn juru rata kostanti (tkabbir lineari jew bilineari). Kif spjegat minn Tzur et al.53, id-distinzjoni bejn it-tkabbir esponenzjali u (bi)lineari teħtieġ preċiżjoni ta '<6% fil-kejl tal-bijomassa, li ma tintlaħaqx għall-biċċa l-kbira tat-tekniki QPM, anke li tinvolvi l-interferometrija. Kif spjegat minn Tzur et al.53, id-distinzjoni bejn it-tkabbir esponenzjali u (bi)lineari teħtieġ preċiżjoni ta '<6% fil-kejl tal-bijomassa, li ma tintlaħaqx għall-biċċa l-kbira tat-tekniki QPM, anke li tinvolvi l-interferometrija. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста третом 6% трестова х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерием интерием. Kif spjegat minn Zur et al.53, id-distinzjoni bejn it-tkabbir esponenzjali u (bi)lineari teħtieġ preċiżjoni <6% fil-kejl tal-bijomassa, li ma tistax tintlaħaq għall-biċċa l-kbira tal-metodi QPM, anke bl-użu tal-interferometrija.Kif spjegat minn Zur et al. 53, li tiddistingwi bejn tkabbir esponenzjali u (bi)lineari teħtieġ preċiżjoni ta 'inqas minn 6% fil-kejl tal-bijomassa, li ma tistax tintlaħaq għall-biċċa l-kbira tal-metodi QPM, anke meta tintuża l-interferometrija. CGM jikseb din l-eżattezza bi preċiżjoni sub-pg fil-kejl tal-bijomassa36,48.
a Time-lapse li jikkonsisti f'6 immaġini OT (immersjoni taż-żejt, 60x, għan NA 1.25) u (b) evoluzzjoni tal-bijomassa mikro-CFU mkejla b'CGM. Ara l-film M7 għal aktar informazzjoni.
It-tkabbir perfettament lineari ta 'S. shibatae kien mhux mistenni u għadu ma ġiex irrappurtat. Madankollu, tkabbir esponenzjali huwa mistenni, għall-inqas minħabba li maż-żmien, iridu jseħħu diviżjonijiet multipli ta’ 2, 4, 8, 16 … ċelluli. Aħna ipoteżijna li t-tkabbir lineari jista 'jkun dovut għall-inibizzjoni taċ-ċelluli minħabba l-ippakkjar dens taċ-ċelluli, hekk kif it-tkabbir taċ-ċelluli jonqos u eventwalment jilħaq stat rieqed meta d-densità taċ-ċelluli tkun għolja wisq.
Aħna nikkonkludu billi niddiskutu l-ħames punti ta 'interess li ġejjin min-naħa tagħhom: tnaqqis fil-volum tat-tisħin, tnaqqis fl-inerzja termali, interess fin-nanopartiċelli tad-deheb, interess fil-mikroskopija tal-fażi kwantitattiva, u firxa ta' temperatura possibbli li fiha jista 'jintuża LA-HTM.
Meta mqabbel mat-tisħin reżistenti, it-tisħin bil-lejżer użat għall-iżvilupp HTM joffri diversi vantaġġi, li aħna nuru f'dan l-istudju. B'mod partikolari, fil-midja likwida fil-kamp viżiv tal-mikroskopju, il-volum tat-tisħin jinżamm fi ftit (10 μm) 3 volumi. B'dan il-mod, il-mikrobi osservati biss huma attivi, filwaqt li batterji oħra huma reqdin u jistgħu jintużaw biex jistudja aktar il-kampjun - m'hemmx bżonn li jinbidel il-kampjun kull darba li jkun hemm bżonn li tiġi ċċekkjata temperatura ġdida. Barra minn hekk, it-tisħin fuq mikroskala jippermetti eżami dirett ta 'firxa kbira ta' temperaturi: Il-Figura 4c inkisbet minn film ta '3 sigħat (Movie M3), li ġeneralment teħtieġ il-preparazzjoni u l-eżami ta' diversi kampjuni - wieħed għal kull wieħed mill-kampjuni li qed jiġu studjati. y hija t-temperatura li tirrappreżenta n-numru ta' jiem fl-esperiment. It-tnaqqis tal-volum imsaħħan iżomm ukoll il-komponenti ottiċi kollha tal-madwar tal-mikroskopju, speċjalment il-lenti oġġettiva, f'temperatura tal-kamra, li s'issa kienet problema kbira ffaċċjata mill-komunità. LA-HTM jista 'jintuża ma' kwalunkwe lenti, inklużi lentijiet ta 'immersjoni taż-żejt, u se jibqa' f'temperatura tal-kamra anke b'temperaturi estremi fil-kamp viżiv. Il-limitazzjoni ewlenija tal-metodu tat-tisħin bil-lejżer li nirrapportaw f'dan l-istudju hija li ċ-ċelloli li ma jaderixxux jew ma jżommux f'wiċċ l-ilma jistgħu jkunu 'l bogħod mill-kamp viżiv u diffiċli biex jiġu studjati. Soluzzjoni tista 'tkun li tuża lentijiet ta' ingrandiment baxx biex tinkiseb żieda akbar fit-temperatura ta 'aktar minn ftit mijiet ta' mikroni. Din il-kawtela hija akkumpanjata minn tnaqqis fir-riżoluzzjoni spazjali, iżda jekk l-għan huwa li jiġi studjat il-moviment tal-mikro-organiżmi, riżoluzzjoni spazjali għolja mhix meħtieġa.
L-iskala tal-ħin għat-tisħin (u t-tkessiħ) tas-sistema \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) tiddependi fuq id-daqs tagħha, skond il-liġi \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), fejn \ (L\ ) huwa d-daqs karatteristiku tas-sors tas-sħana (id-dijametru tar-raġġ tal-lejżer fl-istudju tagħna huwa \(L\ madwar 100\) μm), \(D\) hija d-diffusività termali tal-ambjent (medja fl tagħna każ, ħġieġ u ilma Rata ta 'tixrid\(D\ madwar 2\darbiet {10}^{-7}\) m2/s Għalhekk, f'dan l-istudju, risponsi ta' ħin ta 'l-ordni ta' 50 ms, jiġifieri, kważi istantanju). bidliet fit-temperatura, jista 'jkun mistenni Dan l-istabbiliment istantanju ta' żieda fit-temperatura mhux biss iqassar it-tul tal-esperiment, iżda jippermetti wkoll ħin preċiż \(t=0\) għal kwalunkwe studju dinamiku tal-effetti tat-temperatura.
Il-metodu propost tagħna huwa applikabbli għal kwalunkwe sottostrat li jassorbi d-dawl (per eżempju, kampjuni kummerċjali b'kisi ITO). Madankollu, in-nanopartiċelli tad-deheb huma kapaċi jipprovdu assorbiment għoli fl-infra-aħmar u assorbiment baxx fil-medda viżibbli, li l-karatteristiċi tal-aħħar tagħhom huma ta 'interess għal osservazzjoni ottika effettiva fil-medda viżibbli, speċjalment meta tuża fluworexxenza. Barra minn hekk, id-deheb huwa bijokompatibbli, kimikament inerti, id-densità ottika tista 'tiġi aġġustata minn 530 nm għal infrared qrib, u l-preparazzjoni tal-kampjun hija sempliċi u ekonomika29.
Transverse grating wavefront microscopy (CGM) tippermetti mhux biss l-immappjar tat-temperatura fuq il-mikroskala, iżda wkoll il-monitoraġġ tal-bijomassa, li jagħmilha partikolarment utli (jekk mhux meħtieġ) flimkien ma 'LA-HTM. Matul l-aħħar għaxar snin, ġew żviluppati tekniki oħra ta 'mikroskopija tat-temperatura, speċjalment fil-qasam tal-bijoimmaġni, u ħafna minnhom jeħtieġu l-użu ta' sondi fluworexxenti sensittivi għat-temperatura54,55. Madankollu, dawn il-metodi ġew ikkritikati u xi rapporti kejlu bidliet mhux realistiċi fit-temperatura fi ħdan iċ-ċelloli, possibbilment minħabba l-fatt li l-fluworexxenza tiddependi fuq ħafna fatturi minbarra t-temperatura. Barra minn hekk, il-biċċa l-kbira tas-sondi fluworexxenti huma instabbli f'temperaturi għoljin. Għalhekk, QPM u b'mod partikolari CGM jirrappreżentaw teknika ta 'mikroskopija tat-temperatura ideali għall-istudju tal-ħajja f'temperaturi għoljin bl-użu ta' mikroskopija ottika.
Studji ta 'S. shibatae, li jgħixu bl-aħjar mod f'80 ° C, juru li LA-HTM jista' jiġi applikat biex jistudja l-ipertermofili, mhux biss termofili sempliċi. Fil-prinċipju, m'hemm l-ebda limitu għall-firxa ta 'temperaturi li jistgħu jintlaħqu bl-użu ta' LA-HTM, u anke temperaturi 'l fuq minn 100 ° C jistgħu jintlaħqu fi pressjoni atmosferika mingħajr togħlija, kif muri mill-grupp tagħna ta '38 fl-applikazzjonijiet tal-kimika idrotermali fl-atmosfera. pressjoni A. Lejżer jintuża għat-tisħin tan-nanopartiċelli tad-deheb 40 bl-istess mod. Għalhekk, LA-HTM għandu l-potenzjal li jintuża biex josserva ipertermofili bla preċedent b'mikroskopija ottika standard b'riżoluzzjoni għolja taħt kundizzjonijiet standard (jiġifieri taħt stress ambjentali).
L-esperimenti kollha twettqu bl-użu ta 'mikroskopju homemade, inkluż illuminazzjoni Köhler (b'LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), detentur tal-kampjun b'moviment xy manwali, għanijiet (Olympus, 60x, 0.7 NA, arja, LUCPlanFLN60X jew 60x, 1.25 NA, Żejt , UPLFLN60XOI), kamera CGM (QLSI cross grating, 39 µm pitch, 0.87 mm mis-sensorju tal-kamera Andor Zyla) biex tipprovdi intensità u immaġini wavefront, u kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit mode , minn Hamamatsu) biex tirreġistra l- data murija fil-Figura 5 (għawm batterjali). L-isplitter tar-raġġ dichroic huwa tarf BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Il-filtru fuq quddiem tal-kamera huwa filtru ta 'pass qasir ta' 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Lejżer taż-żaffir tat-titanju (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, kavità tal-laser tsunami ippumpjat, Spectra-Physics f'Fig. 2-5, sostitwit aktar minn laser Millenia, Spectraphysics 10 W, kavità tal-laser Mira ppumpjata, Koerenti, għal Fig. 2 -5). 6 u 7) huma ssettjati għall-wavelength \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, li jikkorrispondi għall-ispettru tar-reżonanza tal-plażmoni tan-nanopartiċelli tad-deheb.Modulaturi tad-dawl spazjali (1920 × 1152 pixels) inxtraw minn Meadowlark Optics L-ologrammi ġew ikkalkulati bl-użu tal-algoritmu Gerchberg-Saxton kif deskritt fil-link 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) hija teknika ta 'mikroskopija ottika bbażata fuq il-kombinazzjoni ta' gradilja ta 'diffrazzjoni bidimensjonali (magħrufa wkoll bħala cross grating) f'distanza ta' millimetru minn sensor ta 'kamera konvenzjonali. L-aktar eżempju komuni ta 'CGM li użajna f'dan l-istudju jissejjaħ interferometru ta' bidla trasversali ta 'erba' tul ta 'mewġ (QLSI), fejn il-cross-grating jikkonsisti f'mudell ta' checkerboard ta 'intensità / fażi introdott u privattiva minn Primot et al. f'200034. Il-linji tal-ħakk vertikali u orizzontali joħolqu dellijiet bħal grid fuq is-sensor, li d-distorsjoni tagħhom tista 'tiġi pproċessata numerikament f'ħin reali biex tinkiseb id-distorsjoni tal-wavefront ottika (jew profil ta' fażi ekwivalenti) tad-dawl inċidentali. Meta tintuża fuq mikroskopju, kamera CGM tista 'turi d-differenza fil-passaġġ ottiku ta' oġġett immaġini, magħruf ukoll bħala fond ottiku (OT), b'sensittività tal-ordni tan-nanometri36. Fi kwalunkwe kejl CGM, sabiex jiġi eliminat kwalunkwe difett fil-komponenti ottiċi jew raġġi, għandha tittieħed immaġni OT ta 'referenza primarja u titnaqqas minn kwalunkwe immaġini sussegwenti.
Il-mikroskopija tat-temperatura saret bl-użu ta 'kamera CGM kif deskritt fir-referenza. 32. Fil-qosor, it-tisħin ta 'likwidu jibdel l-indiċi refrattiv tiegħu, u joħloq effett ta' lenti termali li jgħawweġ ir-raġġ inċidentali. Din id-distorsjoni tal-wavefront titkejjel mis-CGM u tiġi pproċessata bl-użu ta 'algoritmu ta' dekonvoluzzjoni biex tinkiseb distribuzzjoni ta 'temperatura tridimensjonali fil-mezz likwidu. Jekk in-nanopartiċelli tad-deheb jitqassmu b'mod ugwali fil-kampjun kollu, l-immappjar tat-temperatura jista 'jsir f'żoni ħielsa mill-batterji biex nipproduċu immaġini aħjar, li huwa dak li kultant nagħmlu. L-immaġni CGM ta 'referenza ġiet akkwistata mingħajr tisħin (bil-laser mitfi) u sussegwentement maqbuda fl-istess post fl-immaġni bil-lejżer mixgħul.
Il-kejl tal-massa niexfa jinkiseb bl-użu tal-istess kamera CGM użata għall-immaġini tat-temperatura. Immaġini ta 'referenza CGM inkisbu billi l-kampjun jiċċaqlaq malajr f'x u y waqt l-espożizzjoni bħala mezz ta' medja ta 'kwalunkwe inomoġeneità fl-OT minħabba l-preżenza ta' batterji. Minn immaġini OT ta 'batterji, il-bijomassa tagħhom inkisbet permezz ta' sett ta 'immaġini fuq żoni magħżula bl-użu tal-algoritmu ta' segmentazzjoni homemade ta 'Matlab (ara s-subsezzjoni "Kodiċi numeriku"), wara l-proċedura deskritta f'ref. 48. Fil-qosor, nużaw ir-relazzjoni \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), fejn \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) hija l-immaġni tal-fond ottiku, \(m\) hija il-piż xott u \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) huwa kostanti. Aħna għażilna \({{{{\rm{\alpha})))))=0.18\) µm3/pg, li hija kostanti tipika għaċ-ċelloli ħajjin.
Cover slip b'dijametru ta' 25 mm u ħxuna ta' 150 µm miksija b'nanopartiċelli tad-deheb tqiegħdet f'kamra AttofluorTM (Thermofisher) bin-nanopartiċelli tad-deheb iħarsu 'l fuq. Geobacillus stearothermophilus ġie kkultivat minn qabel matul il-lejl f'medja LB (200 rpm, 60 ° C) qabel kull jum ta 'esperimenti. Qatra ta '5 µl ta' sospensjoni ta 'G. stearothermophilus b'densità ottika (OD) ta' 0.3 sa 0.5 tqiegħdet fuq cover slip b'nanopartiċelli tad-deheb. Imbagħad, qoxra tonda b'dijametru ta '18 mm b'toqba b'dijametru ta' 5 mm fiċ-ċentru twaqqgħet fuq il-qatra, u 5 μl ta 'sospensjoni batterjali bl-istess densità ottika ġiet applikata ripetutament fiċ-ċentru tat-toqba. Il-bjar fuq coverslips ġew ippreparati skond il-proċedura deskritta f'ref. 45 (ara Informazzjoni Supplimentari għal aktar informazzjoni). Imbagħad żid 1 ml ta 'LB medium mal-coverslip biex tevita li s-saff likwidu jinxef. L-aħħar coverslip titqiegħed fuq l-għatu magħluq tal-kamra Attofluor™ biex tevita l-evaporazzjoni tal-medium waqt l-inkubazzjoni. Għal esperimenti ta 'ġerminazzjoni, użajna spori, li, wara esperimenti konvenzjonali, xi drabi koprew il-coverslip ta' fuq. Metodu simili ntuża biex jinkiseb Sulfolobus shibatae. Tliet ijiem (200 rpm, 75 ° C) ta 'kultivazzjoni preliminari ta' Thiobacillus serrata twettqu f'medju 182 (DSMZ).
Ġew ippreparati kampjuni ta 'nanopartiċelli tad-deheb permezz ta' litografija tal-kopolimeru tal-blokki miċellari. Dan il-proċess huwa deskritt fid-dettall fil-Kap. 60. Fil-qosor, miċelli li jinkapsulaw joni tad-deheb ġew sintetizzati billi tħallat il-kopolimeru ma 'HAuCl4 fit-toluene. Il-coverslips imnaddfa mbagħad ġew mgħaddsa fis-soluzzjoni u ttrattati b'irradjazzjoni UV fil-preżenza ta 'aġent li jnaqqas biex jinkisbu żrieragħ tad-deheb. Fl-aħħarnett, żrieragħ tad-deheb tkabbru billi tikkuntattja coverslip b'soluzzjoni milwiema ta 'KAuCl4 u etanolamina għal 16-il minuta, li rriżulta f'arranġament kważi perjodiku u uniformi ħafna ta' nanopartiċelli tad-deheb mhux sferiċi fl-infra-aħmar qrib.
Biex tikkonverti l-interferogrammi għal immaġini OT, użajna algoritmu homemade, kif iddettaljat fil-link. 33 u huwa disponibbli bħala pakkett Matlab fir-repożitorju pubbliku li ġej: https://github.com/baffou/CGMprocess. Il-pakkett jista 'jikkalkula l-intensità u l-immaġini OT bbażati fuq interferograms irreġistrati (inklużi immaġini ta' referenza) u distanzi ta 'array tal-kameras.
Biex tikkalkula l-mudell tal-fażi applikat għal SLM biex jinkiseb profil tat-temperatura partikolari, użajna algoritmu magħmul id-dar żviluppat qabel39,42 li huwa disponibbli fir-repożitorju pubbliku li ġej: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. L-input huwa l-qasam tat-temperatura mixtieqa, li jista 'jiġi ssettjat b'mod diġitali jew permezz ta' immaġni bmp monokroma.
Biex nissegmentaw iċ-ċelloli u nkejlu l-piż xott tagħhom, użajna l-algoritmu Matlab tagħna ppubblikat fir-repożitorju pubbliku li ġej: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Fuq kull immaġini, l-utent irid ikklikkja fuq il-batterja jew mCFU ta 'interess, aġġusta s-sensittività tal-bastun, u jikkonferma l-għażla.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-astratt tar-Rapport tar-Riċerka dwar in-Natura marbut ma’ dan l-artikolu.
Id-dejta li tappoġġja r-riżultati ta’ dan l-istudju hija disponibbli mill-awturi rispettivi fuq talba raġonevoli.
Il-kodiċi tas-sors użat f'dan l-istudju huwa dettaljat fit-taqsima tal-Metodi, u l-verżjonijiet tad-debug jistgħu jitniżżlu minn https://github.com/baffou/ fir-repożitorji li ġejjin: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, u CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Intuwizzjoni dwar termofili u l-applikazzjonijiet ta 'spettru wiesa' tagħhom. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Intuwizzjoni dwar termofili u l-applikazzjonijiet ta 'spettru wiesa' tagħhom.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. u Sharma, AK Ħarsa ġenerali tat-termofili u l-applikazzjoni wiesgħa tagħhom. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. u Sharma AK Fehim profond tat-termofili u firxa wiesgħa ta 'applikazzjonijiet.3 Bijoteknoloġija 6, 81 (2016).
Ħin tal-post: 26-Settembru 2022